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chantalle
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2 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2008 : 13:32:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chantalle Invia a chantalle un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao atutti!come, quale reagente e in che proporzione devo variare in un protocollo PCR per aumentare l'intensità della banda visualizzata su gel di agarosio?grazie e buon lavoro a tutti

marok
Utente Junior



150 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2008 : 13:58:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marok Invia a marok un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La PCR non centra niente (solitamente) .Se puoi naturalmente carica + DNA (eventualmente fai 2 reazioni dello stesso campione ed unisci il contenuto). Se no dipende dal metodo di colorazione che usi (etidio?), puoi mettere + colorante (se etidio fai correre il gel meno perchè tende a migrare verso il polo positivo) oppure colorare dopo la corsa incubando il gel con il colorante ed il buffer utilizzato per la corsa, oppure (se non è etidio) lo aggiungi direttemente anche nel buffer di corsa prima della stessa. Ci sono varie strategie, ma comunque se è proprio la PCR che fa schifo, ci sarebbero mille prove da effettuare, comincia a cambiare le concentrazioni di primer e ioni MgCl2+, ed eventualmente diluisci il campione per vedere se cè qualche effetto inibitorio (si potrebbe aggiungere anche BSA).
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2008 : 17:28:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
chantalle,

dovresti essere più specifico... le procedure possono essere infinite, dipende da cosa hai al momento e cosa vuoi ottenere.

1) aumentare i cicli di PCR,
2) aumentare il DNA di partenza o diminuirlo se sei a saturazione
3) aumentare la purezza del DNA da cui parti
4) aumentare la Taq che usi
5) aumentare il volume della PCR o mettere insieme diverse PCR
6) se vuoi concentrare puoi fare una precipitazione con sali ed alcool
7) se vuoi una grossa amplificazione puoi clonare il prodotto ed amplificarlo in batteri
8) puoi diminuire la Tm per facilitare l'annealing ed il prodotto di PCR
9) puoi fare una nested.
10) puoi aumentare il diaframma quando fai la foto

etc etc etc
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