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ameliap
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32 Messaggi

Inserito il - 02 ottobre 2008 : 23:41:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ameliap Invia a ameliap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao, avrei bisogno di una grossa mano!vorrei sapere come faccio a capire se ho sequenziato tutto il gene su cui sto lavorando...non ho trovato online una sequenza di riferimento per la specie su cui lavoro e vorrei confrontare la sequenza finora da me ottenuta con le librerie online ma non so come fare e la mia prof mi sa solo dire di usare i BAC per potermi disegnare altri primer ma non so proprio come fare....
aiuto!

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 02 ottobre 2008 : 23:44:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma il BAC l hai preso con il tuo frammento o hai clonato in BAC? ...che specie e'?


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ameliap
Nuovo Arrivato




32 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2008 : 00:40:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ameliap Invia a ameliap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
niente di tutto ciò, io ho solo il frammento, ho sequenziato utilizzando DNA genomico e adesso vorrei "blastare" la mia sequenza per vedere se riesco a recuperarmi pezzettini vicini per disegnarimi altri primer
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marok
Utente Junior



150 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2008 : 09:27:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marok Invia a marok un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per riuscire a trovare sequenze adiacenti al tuo target potresti provare a digerire il genomico con un enzima di restrizione che taglia frequentemente e lascia le estremità coesive. Fare una ligasi. e provare a fare una pcr con dei primer uscenti... Se trovi l'amplificato, sequenzia.
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2008 : 10:23:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da marok

Per riuscire a trovare sequenze adiacenti al tuo target potresti provare a digerire il genomico con un enzima di restrizione che taglia frequentemente e lascia le estremità coesive. Fare una ligasi. e provare a fare una pcr con dei primer uscenti... Se trovi l'amplificato, sequenzia.




eheheh mannaggia a te...e che si deve fare tutta la libreria???
poi si fa una ligazione non una ligasi

cmq ameliaP ...vediamo se non ho capito bene... la tua prof ti avra' detto prendi un BAC in banca dati e blasta la sequenza ottenuta,e' cosi'?


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ameliap
Nuovo Arrivato




32 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2008 : 14:02:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ameliap Invia a ameliap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
esatto Patrizio la prof mi ha detto proprio così! ma io non so come prenderlo un BAC in banca dati....devo provare col megablast?
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2008 : 14:41:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
nel tuo frammento e' presente un gene? mi daresti il nome?

o altrimenti prova tu

http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=9758

qui c'e' la descrizione di come usare UCSC genome browser,se non trovi il BAC ...fammi sapere


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ameliap
Nuovo Arrivato




32 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2008 : 23:51:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ameliap Invia a ameliap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao Patrizio, la tua spiegazione nel link che mi hai indicato è chiarissima e ho trovato il BAC. il punto è che io pensavo di poter blastare la sequenza che io ho ottenuto con porzioni di sequenza note o non note ma in cui erano presenti anche altre basi, mi spiego:
es mio frammento: "AGTGCAAT"
BLAST col BAC:AATG"AGTGCAAT"GCTAGGT
oltre alle mie basi trovo anche delle"code"su cui potermi disegnare altri primer....così non si può fare?
grazie ciaoo
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Ayla
Utente Junior

guardiano

Città: Wageningen


573 Messaggi

Inserito il - 13 ottobre 2008 : 00:19:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ayla Invia a Ayla un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
e fare una RACE PCR? Non me ne intendo molto ma di solito ti aiuta a allungare la porzione nota...
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ameliap
Nuovo Arrivato




32 Messaggi

Inserito il - 13 ottobre 2008 : 19:10:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ameliap Invia a ameliap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non credo di poter fare una race pcr perchè prevede l'utilizzo di mRNA mentre la mia matrice di partenza è sangue itero congelato quindi mi posso estarre solo il DNA....
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2008 : 22:19:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ameliap

ciao Patrizio, la tua spiegazione nel link che mi hai indicato è chiarissima e ho trovato il BAC. il punto è che io pensavo di poter blastare la sequenza che io ho ottenuto con porzioni di sequenza note o non note ma in cui erano presenti anche altre basi, mi spiego:
es mio frammento: "AGTGCAAT"
BLAST col BAC:AATG"AGTGCAAT"GCTAGGT
oltre alle mie basi trovo anche delle"code"su cui potermi disegnare altri primer....così non si può fare?
grazie ciaoo



si che si puo' fare...il contig hai visto come si chiama? ora la sequenza dovresti cercarla su NCBI nucleotide mettendo il nome del BAC e poi fare il blast

poi cmq,io non l ho mai fatto,ma l RNA lo estraggono da tessuti liofilizzati..penso che anche da sangue congelato si possa fare,ma non
serve nel tuo caso,anche perche' non hai ancora detto che e'


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