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 taq Pfu.... ma come funziona?????
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 18:12:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao
sono nuova del forum e spero che la domanda non sia troppo banale
esistono trucchi particolari per usare la taq Pfu?
mi spiego
devo clonare un prodotto PCR di circa 1400pb
prodotto fatto su un altro plasmide

ho messo a punto le condizioni PCR con la taq normale
e tutto è ok

ora che sto usando la Pfu non ottengo nessun prodotto
e a me serve usare la Pfu... per evitare la A finale della taq normale

aiuto..... non so piu che fare
forse devo aumentare la concentrazione della Pfu
lavoro con 0.14microlitri in 25microlitri di volume finale

grazie

miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 18:59:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusate ma sono ancora io!

stavo pensando
visto che il prodotto PCR lo digerisco per ottenere delle estremità complementari con il mio nuovo plasmide

posso usare la taq normale?
anche se ottengo l'aggiunta della A finale
poi la taglio con gli enzimi
giusto?

grazie
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 19:22:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se tagli il prodotto di PCR con degli enzimi di restrizione su entrambi i lati non hai problemi riguardanti l'aggiunta della a finale.
Tuttavia considera che la pfu e la Taq non si distinguono solo per l'aggiunta della a finale, bensì la pfu è un enzima più costoso perché è più accurato nell'amplificazione, ovvero commette meno errori.
Se devi clonare un prodotto di pcr e ti serve che la sequenza sia mantenuta senza errori, la taq normale non è una buona scelta per un prodotto di 1400 bp, poiché dovresti trovare il clone non ha errori nella sequenza, con la pfu questo problema è meno sentito.

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 19:36:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Premetto che ho un odio personale per la Pfu!
Anche se credo l'abbiamo migliortata.
Comunque per rispondere alla prima domanda, le condizioni non sono le stesse della Taq, spesso quello che viene con la Taq non viene con la Pfu. Devi utilizzare più dNTPs e aliquote sempre fresche, più enzima (la quantità la devi vedere in Unità non in microlitri! "0.14microlitri in 25microlitri di volume finale" non vuol dire niente se non si sa a che concentrazione è).
Altro non ti so dire perchè già anni fa dopo qualche prova con la Pfu mi sono stufata e sono passata alla Pfx risolvendo tutti i miei problemi!

Per la seconda domanda, certo se tagli con enzimi di restrizione non ti interessa la A finale. Però ricorda che la Pfu ha attività di proof reading e quindi introduce meno errori rispetto alla Taq, per questo è preferita nei clonaggi. Comunque puoi anche usare la Taq, l'unica cosa che ti consiglio è fare una sequenza per verificare che il prodotto ottenuto non contenga errori.



Edit: mi ha battuto Neuroscience sul tempo! Il PC del labo è lentissimo!
... comunque vedo che concordiamo sulle risposte!
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 19:39:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok grazie

si devo clonare di nuovo il prodotto PCR in un nuovo plasmide

quindi meglio la Pfu
ma perche' la PCR con la pfu non viene?
forse serve un concentrazione piu elevata di pfu?

forse 0.14microlitri in 25di volume finale
sono pochi

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 19:42:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ahah ci stiamo accavallando con le risposte!
Ho risposto sopra, comunque dovresti anche avere un "protocollo" assieme alla Pfu no?
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 19:47:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok avete ragione 0.14 microlitri non significa nada
e personalmente ho un certo odio per la Pfu anche io

inoltre devo sequenziare il mio plasmide
perchè dopo che ho ottenuto quello giusto
lo devo riaprire e metterci un altro prodotto PCR

sto facendo un plasmide con due geni presi da altri plasmidi
un po complicato... lo so!

ok quindi provo a seguire le indicazioni per usare meglio la Pfu
e se non ottengo risultati
ritorno alla taq tradizionale... sequenzio il mio plasmide
e continua a lavorare
sono giorni che combatto per ottenere il prodotto PCR
figuriamoci che poi ne devo fare anche un altro!

ho anche la taq gold in laboratorio
forse è migliore?
non credo!
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 19:54:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si
ci stiamo accavallando

si ho un protocollo fornito dalla ditta
ma avendo messo a punto la Pcr con altre condizioni
pensavo che funzionasse

non sempre uso dntp freschi... non sapevo che la Pfu era cosi sensibile
e rispetto al loro protocollo
metto meno dntp e MgSo4

ok provo di nuovo la PCR con Pfu e condizioni del loro protocollo
e vostri consigli
e sperem che viene

grazie mille
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 22:05:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Bene diro' la mia
per quanto riguarda la pfu...premetto che non l ho mai usata,pero' vedi bene quante unita' metterne se 1,25UI/uL o piu' o meno,sempre in base al protocollo visto che stiamo parlando di enzima.....per la taq gold,sara' poco meglio di quella normale,e' una taq che si attiva a piu' alte T°,e credo che le A le metta ugualmente

cmq sinceramente....anche la classica taq non mette a tutti i frammenti le A ,quindi potresti provare a clonare,io ho clonato in un vettore dove servivano estremita' blunt ...e' vero che non sono uscite miriadi di colonie,pero' il clonaggio e' uscito!

per questo riguarda la digestione con l enzima....io non credo che ce la farai a digerire le estremita' di un amplificato,gli enzimi di restrizione hanno bisogno di un frammento lungo in genere e con 10-15 nt dall estremita' ho i miei dubbi...non s acchiappa!,pero' anche questo dipende da che enzimi usi...in che laboratorio stai...etc(io non lo farei),quindi ti consiglierei di passare in TA vecotor digerire e poi clonare nell altro

questa e' la mia opinione


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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2008 : 23:48:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh in effetti a me serve solo una colonia giusta


non chiedo altro

concordo che il metodo TA vector è piu sicuro
ma non essendo io il capo...
sono tornata dalle vacanze e i due capi che ho
avevano gia deciso la strategia e ordinato i primers
quindi o bere o affogare!

io spero di riuscire a taglire il prodotto
se mai l'ottengo!


ma uso enzimi ottimi (eco rI e hind III)
e i primers che hanno disegnato hanno un buon margine
dovrebbe funzionare
se ottengo il prodotto pcr

grazie
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Anyra
Utente Junior

Anyra

Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara


212 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2008 : 10:52:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Anyra Invia a Anyra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dità anch0io la mia:
Concordo con GFPina sull'odio per la pfu (si perde un sacco di tempo e si ottiene un decimo di quello che serve.

Fai un giro in lab e vedi se qualcuno più furbo usa la KOD XL della novagen, è una proofreading e va che è una bomba, basta aggiungere solo i primers e il templato alla mix, niente condizioni da modificare se non le temperature di anealing.

A proposito hai provato ad abbassare di qualche grado la ta (1 o 2), se hai dei primers ccon dei mismatch magari è quello il problema.

Per rispondere poi a Patrizio io solitamente clono utilizzando i siti di taglio sui primers, l'accortezza è quella di lasciare 6-7 nucleotidi dall'estremidà per permettere all'enzima di attaccarsi, e controllare di quante basi necessitano per tagliare al 100%.


Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2008 : 11:32:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

in tutto l'edificio sono l'unica che clona!
un edificio di tre piani.... pieno di gente che fa solo cellule
e western

che tristezza

eh eh

quindi mi devo accontentare della taq e pfu
ho solo una polimerasi che si chiama Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerases della finnzymes
un rappresentante me l'ha portata
dice che fa miracoli
ma non lìho mai provata
forse puo' essere una buona occasione!

ok per ora riprovo la pfu
poi questa miracolosa polimerasi
e se no
viva la taq e clono con quella
tnato poi sequenzio

gracias a todos


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mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2008 : 23:49:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ehm...io la Pfu non la odio!
Certo,è un po' esigente...
Sinceramente io l'ho usata e non mi ha dato problemi. I miei colleghi la usano praticamente sempre e anche loro non hanno problemi.
Io seguo quanto c'è scritto nel datasheet, anche come prot. termico. tutto qui...
...mi dispiace di non poterti esssre d'aiuto più di così.
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2008 : 00:00:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non ti preoccupare ogni parola è utile

ho rifatto la PCR e si concordo la Pfu è esigente
se metto quantità industriali di dNTP e Pfu
FUNZIONA!!!

quindi la morale è
con le quantità che servono per far funzionare la Pfu ci si fanno 3 PCR della taq normale

ma sembra che ora ho il mio prodotto
e posso continuare (almeno spero) il mio clonaggio

grazie mille a tutti
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2008 : 00:06:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Bene buona continuazione allora!

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Anyra
Utente Junior

Anyra

Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara


212 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2008 : 10:28:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Anyra Invia a Anyra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In bocca al lupo
e crepi l'avarizia

Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw
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