| Autore |
Discussione |
|
|
STEFY86VA
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 09 ottobre 2008 : 14:17:05
|
sono disperata, tra 10 gg devo consegnare la mia tesi e non ho dei risultati, facendo il western sds-page per nf-kb riesco a induviduare il totale ma non il fosfo.. non capisco se sbaglio qualcosa nell'estrazione, o nella corsa, i problemi di anticorpo li escludo xkè prima funzionava..sono disperata davvero aiutatemi
|
|
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 09 ottobre 2008 : 17:10:44
|
io lavoro con le proteine fosforilate e ti rassicuro dicendoti che non sempre è facile. cerca di capire se ogni passaggio è fatto correttamente:
1: usi inibitori delle fosfatasi nel buffer di lisi? in quale concentrazione?sono freschi?
2: sei davvero sicuro che il tuo anticorpo funzioni?
3: quante proteine carichi?
4: hai provato a fare uno sviluppo con un ECL più sensibile? proprio oggi ho sviluppato una lastra con ECL normale per una fosfoproteina e non avevo segnale, poi ho reincubato la membrana con il PLUS e ho avuto delle bande stupende.
5: i campioni vengono continuamente congelati e scongelati?
 |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
 |
|
|
STEFY86VA
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 11:14:02
|
inibitori delle fosfatasi uso NaO alla concentrazione finale di 20mM e NaF alla conc finale 30mM,
tengo i campioni in ghiaccio o frigo, non li congelo,
carico 100 ug di proteine e ho uno sviluppo ecl normale non plus.. ma non si vede niente di niente |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 12:16:49
|
| NaO??? forse l'ortovanadato che io uso 2mM, poi aggiungo anche NaF 10mM, Na-pirofosfato 10mM e beta glicerofosfato 10mM. io ho cominciato a farne degli stock che poi aliquoto e congelo a -20°C. prova a metterci sopra l'ecl plus, magari è solo questione di debolezza di segnale se escludi tutte le altre possibilità. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 11 ottobre 2008 : 10:35:41
|
| tenere i campioni a 4° C però può aumentare la loro degradazione...le proteine fosforilate sono sempre un bel problema..io per la mia ho dovuto cambiare tecnica abbandonando il western..prova a estrarre da pellet fresco..noi come inibitori delle fosfatasi utilizziamo dei cocktail già pronti.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
errore di stampa... |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2008 : 10:57:32
|
| si ma infatti i lisati totali per detectare una fosfoproteina andrebbero corsi immediatamente dopo l'estrazione. in alternativa, io riesco ad ottenere buoni risultati anche su lisati conservati a -80°C, ma per non più di un mesetto. assolutamente da evitare -20°C o 4°C |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
| |
Discussione |
|
Western proteine fosforilate
Didattica e Relazioni
