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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
 Inserito il - 09 ottobre 2008 : 18:37:29
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Ciao a tutti!!!!
Sto studiando il clonaggio di DNA genomico e cDNA e la costruzione delle rispettive genoteche.
Non mi sono chiari i metodi di screening delle genoteche...qualcuno mi sa aiutare?
Alcuni metodi sono gli stessi vero?
es ibridazione, PCR...altri?
Aiuto.
Ciaooo
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2008 : 22:00:07
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Lo screening delle genoteche viene fatto o prendendo in considerazione la sequenza del DNA,cDNA oppure in base alla proteina e funzione che ha,nel primo caso si utilizzano le sonde o la PCR come hai gia’ detto,nel caso invece tu voglia screnare una genoteca in base alla proteina o la funzione che essa ha,innanzitutto ti servira’ clonare in una genoteca di espressione e lo screening puo' essere effettuato con un anticorpo specifico oppure nel caso di un enzima, in base alla sua attivita' |
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 10:38:44
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Vediamo se ho capito:
Pe DNA: PCR e sonde
Per cDNA : PCR, sonde, anticorpi, attività enzima
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 11:34:53
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exacly  ...ripeto che dipende in che vettore e' stato fatto il clonaggio
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 11:44:50
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Mi chiarisci un altro dubbio visto che sei così gentile?
Si costruiscono genoteche quando si vuole clonare DNA genomico o cDNA nel caso non si conosca la posizione del gene ma la funzione...
I passaggi sono:
estrazione del DNA o mRNA
frammentazione
inserimento in un vettore specifico
inserimento in cellula ospite: è qui che avverrà il clonaggio giusto?
Tramite la replicazione del vettore...
quindi si ottengono più copie dei cloni rappresentativi del DNA
Ma ciò che si chiama genoteca è questa o i cloni che avevamo all'inizio inserito nel vettore e nella cellula ospite??
Dopo la replicazione abbiamo duplicati...o no??
aiutooooooooooooooooo |
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 11:54:58
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Mentre scrivevo ci riflettevo...
la genoteca è sì l'insieme dei frammenti del DNA o cDNA
Si inseriscono in vettore e in cellula ospite per avere più copie...una quantità maggiore per rendere più facile l'analisi e l'individuazione del clone d'interesse giusto?
Un alternativa al clonaggio è la pcr: nel caso del DNA soltanto però credo...perchè conosco la posizione del gene
Utilizzando primer specifici amplifico solo il gene d'interesse...senza dover ricorrere alla genoteca....giusto?
Petriziooooooooooo
GRAZIE!
ciao |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 16:53:31
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Visto che ci hai riflettuto,ti rispondero' sulla seconda...
la genoteca nel caso del DNA genomico ...anche se a dire il vero mi suona male,e' l insieme dei frammenti di DNA (Lbrary Genomiche),ma nel caso del cDNA non hai i frammenti,ma mRNA retrotrascritto e clonato (Library di cDNA)
La trasfezione o l uso dei fagi avviene non tanto per un analisi piu' dettagliata o che,ma cosi' tu le puoi conservare e facilmente ottenere senza stare li a clonare ogni volta
La PCR non clona... PCR = polymerase chain reaction but not polymerase clone reaction 
e bene si,in teoria puo' essere usata per ottenere qualsiasi gene che t interessa |
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2008 : 19:02:58
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Bè quindi nn era giusto nulla...
In effetto sono un pò incasinata.
Sul miolibro si parla di:
1)di DNA genomico
2)di cDNA
3)d'espressione
4)differenziale
5)funzionale
6)posizionale
e sinceramente mi si stanno confondendo le idee
Io sapevo che esistevano 2 tipi di genoteche:
1)DNA genomico...posizionale
2)cDNA....posizionale, d'espressione o funzionale (credo in base al fatto che la proteina sia o no funzionale...?)
giuto fin qui?
Resta fuori il differenziale..che ho trovato nel capitolo delle genoteche di cDNA perchè è caratteristica degli mRNA....MA CHE ROBA è?
aiutooooo  |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2008 : 15:01:18
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quindi,
GENOTECHE
1)di DNA genomico
2)di cDNA
CLONAGGI:
3)d'espressione(in genere cDNA),e' il clonaggio che ti permette di screenare la lybrari nel caso in cui tu non abbia una sonda o la sequenza e' sconosciuta
4)Differenziale(si fa riferimento ai trascritti),come dice il nome...ti permette di vedere le differenze tra 2 campioni,ad esempio vuoi vedere se in un campione un gene e' piu' espresso rispetto ad un altro,oppure se c'e' una mutazione in una linea cellulare...quindi avrai un trattato e un controllo,cioe' per dilla breve non e' un clonaggio nel senso che prendi il vettore e ci metti l inserto...ma e' un analisi che puo' essere fatta mediante PCR o con genoteche di cDNA
5)Funzionale,..viene fatto un saggio per identificare la proteina o enzima
6)Posizionale,questa e' una procedura molto complessa che ti consente di localizzare un gene d interesse,e le strategie usate dipendono dalle informazioni che si hanno a disposizione
mi correggo,nel post precedente avevo detto trasfezione anzicche' trasformazione |
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2008 : 23:38:44
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Chiaro come sempre!Grande!!
Però prima di eseguire il clonaggio dovrò costruire la genoteca? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2008 : 08:51:13
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| Il clonaggio "alla lettera",e' la formazione di un costrutto dato da un vettore e il tuo inserto con cui ci puoi costruire la genoteca totale o parziale(di un singolo chromosoma),in base al tipo di vettore usato lo chiami di espressione etc...che ti permette di identificare il clone |
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screening genoteche
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