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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
 Inserito il - 12 ottobre 2008 : 11:31:12
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Ciao a tutti
Ho guardato tutte le discussioni a tal proposito...ma avrei bisogno di chiarire delle cose...
Sto studiando i 2 metodi:
1)sequenziamento ordinato
-frammentazione DNA in frammenti grandi (perchè grandi?)
-mappaggio di ciascun frammento sequenziando le estremità dei lunghi inserti inseriti in BAC
-assemblaggio di un contiguo: in base alle zone sovrapposte
2)shotgun
-frammentazione del DNA in piccoli frammenti
-frammentazione del DNA in frammenti grandi
-inserimento in vettori
-trasformazione di cellule batteriche
-sequenziamento di ciascun frammento: attraverso sequenziatori automatici
-inserimento dati delle sequenze dei singoli frammenti in PC : per costruzione del contiguo
non è necessaria un mappa fisica preliminare...cioè non si conosce la posizione dei geni?mentre nell'approccio dei cloni cloati sì?
Perchè nello shotgun si fanno 2 genoteche:frammenti piccoli e grandi?e si inseriscono in vettore???
sequenziamento shotgun
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2008 : 12:52:23
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Ti rispondo ma forse non ho ben capito la tua domanda…
Credo tu stia parlando della hierarchical shotgun strategy e della whole genome shotgun strategy per sequenziare interi genomi.
Nella prima tecnica, innanzitutto si frammenta il genoma in grandi inserti che vengono clonati in vettori BAC. Si ha quindi la libreria BAC. Bisogna però costruire una mappa fisica di questo cloni, grazie a marcatori specifici, in modo da sapere più o meno dove ciascun BAC è localizzato nel genoma. A questo punto si sequenziano le estremità di ciascun BAC e si trovano i BAC contigui che si sovrappongono il meno possibile (in modo da non sequenziare troppe basi per niente).
Per ciascun clone BAC si fa poi una libreria shotgun, ovvero il clone BAC si frammenta in piccoli inserti che vengono clonati in vettori plasmidici e vengono sequenziati. Segue l’assemblaggio e il finishing dei piccoli inserti e quindi di ciascun BAC.
Nella seconda tecnica l’intero genoma si frammenta in piccoli inserti, senza una mappa fisica. Ovviamente questi inserti devono essere inseriti in vettori e trasformati in batteri. Questi inserti si sequenziano e si assemblano grazie alle zone di sovrapposizione. In genere si fanno almeno 2 librerie di inserti di lunghezza diversa, una con inserti più piccoli e una con inserti più grandi, in modo da riuscire a risolvere con gli inserti più grandi zone complesse, ad esempio ricche di ripetizioni.
Diciamo che la seconda strategia è più veloce, ed è perfetta ad esempio per i genomi dei procarioti. Per genomi più complessi, con molte zone ripetute etc, meglio la prima anche se più laboriosa.
Spero di aver risposto alle tue domande, altrimenti chiedi ancora! |
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2008 : 13:36:40
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Grazie metionina!
Ma io avevo capito che nella metodica shotgun non vi era la necessità di una mappa fisica...cosa indispensaile invece nel sequenziamento ordinato.... |
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2008 : 13:57:47
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si infatti è così.
La base della tecnica del "sequenziamento ordinato" è appunto quella di sapere dove sono posizionati i BAC, e per sapere questo devi avere una mappa fisica.
In quello "shotgun" il vantaggio è la velocità, e dunque si basa sul fatto che metterai insieme i vari frammenti grazie alle sovrapposizioni, senza mappa fisica. |
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ilatwins
Utente Junior
Città: pavia
121 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2008 : 14:05:03
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| Perfetto! Quindi chromosome walking e linking clone si usano nello shotgun? |
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2008 : 14:17:44
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il "chromosome walking" di solito lo usi per sequenziare una parte fiancheggiante una zona di interesse, esempio un gene malattia, per individuare geni vicini. é come se a partire da un punto noto risalissi il cromosoma "camminando" su di esso per vedere cosa c'è vicino.
il "linking clone" come termine così non l'ho mai sentito, ma immagino si riferisca al mettere insieme cloni contigui. Questo si lo fai nel sequenziamento shotgun. |
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biotecman
Nuovo Arrivato
40 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2009 : 16:38:07
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scusate ma quando nel shotgun sequencing mi creo il "minimal tiling path" cioè la collezione di BAC in grado di coprire la mia regione cromosomica con il minor grado di sovrapposizione, si può dire che lo faccio tramite il chromosome walking?
Poi per quanto riguarda invece il whole genome shotgun, nel momento in cui vado a risolvere le zone complesse con la libreria con inserti più grandi, per quelle zone la procedura diventa identica al sequenziamento gerarchico (clone by clone) (mi creo una shotgun library dal clone bac della regione complessa)? |
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