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giuseppe.gangarossa
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 16 ottobre 2008 : 23:35:59
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Ciao a tutti,
da un paio di mesi a questa parte mi sono spostato dal campo comportamentale a quello biomolecolare. Vorrei sapere se qualcuno mi può dare una mano con la statistica su western blot. Cerco di spiegarmi meglio...una volta effettuata la lettura delle bande normalizzate con lo standard (es. actina) come mi comporto per vedere se le mie eventuali alterazioni di proteine sono statiscamente significative? Posso confrontare i dati provenienti da gel diversi? Posso fare le medie con le letture delle successive replicazioni della western? Faccio un esempio:
Faccio una western su 4 tessuti provenienti da 4 animali. Ogni tessuto naturalmente ha il suo controllo. Faccio una prima western e mi viene una riduazione di una certa proteina del 60% (con relativo errore standard). Il giorno successivo altra western e mi viene una riduzione del 75%; in un altro esperimento successivo riduzione del 55%...Per effettuare l'analisi statistica tengo in considerazione tutte e tre le letture e quindi ne faccio una media? o mi comporto diversamente?
Inoltre volevo chiedere a chi di competenza se è possibile incubare una membrana contemporaneamente con due anticorpi diversi (uno per lo standard e l'altro per la proteina incognita). Così facendo potrei risparmiare un bel pò di tempo. Ci possono essere problemi di interferenza tra i due anticorpi?
Come ultimo volevo sapere se qualcuno di voi ha un buon protocollo dettagliato sull'omogenizzazione ed estrazione delle proteine da tessuto in modo da affinare il protocollo di cui dispongo (che mi sembra un pò scarso)!
Spero di nn avervi spaventato con tutta questa serie di richieste!
Grazie mille 
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decesare
Nuovo Arrivato
Prov.: Chieti
Città: Chieti
22 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 10:49:14
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Per quella che è la mia esperienza se hai "sempre" una riduzione rispetto ad un controllo su tre WB diversi non hai neanche bisogno della statistica, sei praticamente "certo" che il tuo stimolo diminuisce l'espressione di quella proteina.
Magari ci fossero sempre risultati così, il problema è che quando fai 3 WB di solito in uno non cambia niente, in uno il segnale aumenta e nell'altro diminuisce!
Punto secondo, io so che non si possono mettere due anticorpi su uno stesso filtro, almeno non contemporaneamente; noi di solito tagliamo il fitro per usare le due parti con due anticorpi.
Per l'omogeneizzazione hai provato a vedere la sezione PROTOCOLLI del sito? Se fai una ricerca ne troverai a centinaia, ma penso che più o meno saranno tutti simili:
-Un tampone a pH fisiologico a cui aggiungere inibitori delle proteasi (ci sono dei cocktail di inibitori che si vendono già pronti)
-disgregazione con potter o ultra turrax o sistemi con sferette d'acciaio, dipende da grandezza e consistenza del tessuto;
-sonicazione dell'omogenato
-centrifugazione
-il tutto con intevalli di incubazione, tempi, quantità diverse.
Comunque se i tuoi risultati così buoni il tuo metodo andrà bene.
Saluti
Domenico |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2008 : 12:49:29
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Citazione:
Posso confrontare i dati provenienti da gel diversi?
Assolutamente no! Normalizza i dati relativamente allo std interno (es. actina) di ciascun campione e poi rapportali al controllo di quel particolare esperimento.
Citazione:
Posso fare le medie con le letture delle successive replicazioni della western?
Assolutamente sì!! Il procedimento che hai spiegato tu è corretto. Se nel primo western hai una riduzione del 55% e nel secondo del 57% potrai dire che hai una riduzione media del 56% (+- errore std.)
Poi applichi un t-test o un ANOVA (a seconda di quanti trattamenti hai) e finalmente puoi ottenere il tuo p-value altamente significativo!
Concordo con Domenico per quanto riguarda i due anticorpi: conviene tagliare la membrana e incubare le due parti separatemente, per evitare interferenze fra i due anticorpi. Poi, puoi anche provare a incubarli insieme e vedere se funzionano, ma tagliando la membrana sei sicuro che funzionerà.
Il protocollo citato credo sia questo: http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=10 oppure http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=11 |
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giuseppe.gangarossa
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2008 : 00:49:23
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Ragazzi vi ringrazio per il vostro intervento!!!
1) Quello del taglio della membrana e la rispettiva incubazione con i rispettivi anticorpi mi sembra un'ottima idea!
2) Come faccio a scegliere il volume del buffer di lisi? Credo di aver letto da qualche parte che il volume del buffer dipende dal peso del tessuto, ma esiste una correlazione diretta, una qualche equazione?
3) Per quanto riguarda la statistica...oltre a fare la media delle eventuali riduzioni di proteina di ogni esperimento devo fare anche le media dei relativi errori std?
esempio: I exp. riduzione del 15% (+- 2) ; II exp. riduzione del 35 (+-7) ; III exp. riduzione del 24% (+- 3.5). Alla fine mi verrebbe 24.7% (+- 4.17) ?  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2008 : 09:34:20
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Citazione:
Come faccio a scegliere il volume del buffer di lisi? Credo di aver letto da qualche parte che il volume del buffer dipende dal peso del tessuto, ma esiste una correlazione diretta, una qualche equazione?
Non credo esista una vera e propria equazione, la cosa è molto empirica... anche perchè dipende da che tipo di tessuto stai estraendo: un tessuto cartilagineo sarà più difficile da digerire rispetto ad un tessuto molle.
Se non ricordo male io usavo 1.5ml di buffer per un cervello di topo, ma ti sto parlando di 4-5 anni fa, quindi non ne sono certissimo.
Citazione:
Per quanto riguarda la statistica...oltre a fare la media delle eventuali riduzioni di proteina di ogni esperimento devo fare anche le media dei relativi errori std?
esempio: I exp. riduzione del 15% (+- 2) ; II exp. riduzione del 35 (+-7) ; III exp. riduzione del 24% (+- 3.5). Alla fine mi verrebbe 24.7% (+- 4.17) ?
Io ricalcolerei l'errore std a partire dalle singole medie. Dovrei ripescare degli appunti sulla teoria degli errori ma non credo che sia corretto fare la media degli errori. Lascio la parola a qualcuno più esperto in statistica... |
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lucry
Nuovo Arrivato
Prov.: ta
Città: taranto
6 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2008 : 19:05:21
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ciao!! Io lavoro su muscoli e cervelli di topi, quindi posso dirti che il volume del buffer di lisi più consigliato e' di 15 volumi. Significa che se il tessuto in esame pesa, ad esempio 1 grammo lo omogenizzerai in 15 ml di buffer..se pesa 110 mg , il volume sarà 1.65 ml..e cosi via, per i vari pesi.
invece se ti occorre sapere in quanto buffer contenente detergente solubilizzare, quello dipende dalle dimensioni del pellet che ottieni. in genere io solubilizzo in 1 ml..ma anche meno.
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TMax
Utente Junior
Prov.: BG
Città: Capriate
270 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2008 : 23:14:36
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io non ho ben capito dove e come dovresti applicare l'analisi dei dati!
non mi è chiaro il disegno dello studio...
non so molto di lab, mi occupo di biostatistica ma cosi capisco poco non riesco ad esserti utile.
Max |
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