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josella
Nuovo Arrivato



1 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2008 : 17:33:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di josella Invia a josella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti.Mi sono appena iscritta (in realtà siamo in 2.....io e la collega che lavora in lab con me) perchè cerco risposte e aiuto per un problema che ci assilla da qualche settimana.
Il problema è questo: usiamo gel precast (invitrogen) per la corsa elettroforetica.Ultimamente le proteine corrono in maniera anomala....Non sempre e non in tutte le lanes.Quello che vediamo al rosso ponceau è una specie di striscia sottile al posto del normale "bandeggio" delle lanes.Il problema è sicuramente nella corsa perchè già all'uscita dai pozzetti si vede la tendenza a formare una specie di striscia invece della normale banda.Le condizioni di corsa sono:80V per circa 20 minuti e poi 120-150V fino a 2 ore-2 ore e mezza.L'amperaggio viene automaticamente regolato dal sistema.Potrebbe trattarsi di un problema di temperatura?Siamo in Sicilia e qui è ancora estate!!!!
Grazie mille per qualunque suggerimento!


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domi84
Moderatore

Smile3D

Prov.: Napoli


1444 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2008 : 20:29:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
150 V mi sembrano un po' tantini...! Riempi la vaschetta di buffer? Lo fai in camera fredda?
Prova per una sola volta a correre tutto il gel a 80/100 V.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11351 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2008 : 21:14:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Altro problema potrebbe essere il running buffer. Lo riutilizzate più volte?
Dopo un po' di volte (e per gli esperimenti importanti) conviene farlo fresco.

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7923 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2008 : 22:03:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma io sono l'unica pazza che lo fa correre a 200V???
Mai avuto problemi di questo genere per il voltaggio! Casomai per altri motivi!

Comunque io propendo per un problema del gel! Sarà che oggi una ragazza ha fatto migrare per la prima volta un gel precast Invitrogen dato in campionatura prova con tutta la strumentazione e... non vi dico che cosa è venuto! Purtroppo la foto non l'abbiamo fatta!
Ma dopo 1h30 ad un voltaggio non elevato (consigliato dal libricino) erano migrati solo nel primo terzo del gel, ma le bande dello standard sembravano ben separate, l'unico problema era il colorante che non si era appiattito ma sembravano delle nuvolette colorate. Aumentando il voltaggio dopo qualche decina di minuti, le bande si sono ricompattate!!!
Riproveremo con un altro tipo di buffer.

Comunque concordo con chick80 di provare con buffer fresco, assicuratevi che sia bello freddo prima di utilizzarlo e se si scalda mettete di fianco alla celletta dei siberini!


GFPina ^_^

GFPina non Pina!!! (GFP)

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me
Nuovo Arrivato




15 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2008 : 10:56:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di me Invia a me un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao! anche io uso i precast dell'invitrogen 3-8%.
Io li faccio correre per 1h a 200V a RT,senza avere alcun tipo di problema di bande..l'unica accortezza è che tengo sempre lo stock di running buffer a 4°C e me ne preparo un po' ogni volta che devo correre un nuovo gel. Per evitare che si surriscaldi tutto riempio la camera esterna dell'apparato con un bel po' di buffer, ma, ti ripeto, faccio tutto a temperatura ambiente senza problemi.
Per curiosità:
- i tuoi estratti ti danno problemi solo quando li carichi nei Novex o anche su un gel normale?
- stai usando magari un Laemlii buffer o un Reducing Agent un po' vecchi?
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2008 : 13:48:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la cosa strana però è il marker che ha corso bene...

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7923 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2008 : 17:30:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Iside

la cosa strana però è il marker che ha corso bene...


Beh è la stessa cosa che è successa nel nostro laboratorio con la seconda prova del gel precast Novex! Lo standard era migrato bene ma i campioni no!
Che ci sia in giro una partita di gel fatti male???

GFPina ^_^

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me
Nuovo Arrivato




15 Messaggi

Inserito il - 05 novembre 2008 : 15:03:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di me Invia a me un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se il problema fosse del gel, allora anche i marker sarebbero corsi male..è un problema di estratti..
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exalibur
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 03 dicembre 2008 : 19:43:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di exalibur Invia a exalibur un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche io sto avendo problemi con il trasferimento nel senso che ho fatto due gel di cui uno si è trasferito bene ed è il posteriore quello anteriore per metà. Io uso i gel con un solo pozzetto e anche lo standard non corre benissimo.
Le condizionei della corsa sono 35 minuti a 200v mentre il trasferimento 2ore a 30V.
Uso sempre le soluzioni preparate al momento.
Transfer: Nupage20x 50ml
Metanolo 100 ml per gel a un litro con acqua distillata.
usiamo gel precast (invitrogen)
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


556 Messaggi

Inserito il - 04 dicembre 2008 : 10:44:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche noi usiamo il Nu PAGE della Invitrogen 4-12% i miei problemi fin'ora sono stati altri, ma negli ultimi due gel corsi per ognuno dei gel ho avuto un campione che si è comportato come descritto da josella, ma pensavo fosse colpa del campione, magari che si fosse degradato.
Una domanda, quando mettete i campioni a denaturare lo fate nelle provette da 1.5 o in quelle da PCR, perchè in quelle da 1.5 mi si aprono continuamente i tappi.
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato



116 Messaggi

Inserito il - 04 dicembre 2008 : 17:20:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mattia.dinunzio Invia a mattia.dinunzio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
puoi risolvere il problema delle Epp che stappano comprando quelle con la Safety Lock!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7923 Messaggi

Inserito il - 04 dicembre 2008 : 21:21:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sul gel precast non dico più niente perchè non vorrei fare troppa pubblicità negativa! (a parte il fatto che se fosse un problema dei campioni perchè succede solo con il gel precast e non con quello fatto a mano???)

Ma rispondo a cin:
una opzione è quella di usare provette da 1.5 Safe Lock come dice mattia.dinunzio, anche se ho notato che anche quelle normali alcune stanno chiuse e altre no (dipende dalla marca!).
L'altra opzione è chiudere le provette con parafilm!

GFPina ^_^

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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


556 Messaggi

Inserito il - 05 dicembre 2008 : 09:40:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma allora la mia pensata di mettere le provette da PCR in un termociclatore per denaturare i campioni è una cavolata?

Da quello che dite dei gel pre cast mi sorgono un mare di dubbi....i nostri sono persino scaduti!
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato



116 Messaggi

Inserito il - 05 dicembre 2008 : 11:13:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mattia.dinunzio Invia a mattia.dinunzio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
no non è una cavolata. conosco gente che lo fa.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7923 Messaggi

Inserito il - 05 dicembre 2008 : 13:50:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da cin

Ma allora la mia pensata di mettere le provette da PCR in un termociclatore per denaturare i campioni è una cavolata?

Da quello che dite dei gel pre cast mi sorgono un mare di dubbi....i nostri sono persino scaduti!


No beh non volevo farti sorgere tutti questi dubbi!
Diciamo che la mia brevissima esperienza con i gel Novex non è stata delle migliori! Ma molti li usano quindi...
se presumi un difetto nel gel puoi provare a contattare il servizio tecnico... ma se i gel sono scaduti... tempo tu non possa fare niente!

Per le provette da PCR per denaturare i campioni, come ha detto anche mattia.dinunzio (concordo sempre con lui ) è una soluzione, noi te ne abbiamo solo dette altre! Poi sta a te in base alle necessità e a quello che avete in laboratorio decidere cosa fare!


GFPina ^_^

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giov.linux
Nuovo Arrivato

Prov.: Bolzano
Città: napoli


14 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2008 : 02:52:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di giov.linux Invia a giov.linux un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per josella
1. ma mi parli di gel e i fai vedere un filtro??? hai provato a colorare anche il gel per sicurezza? se scaldi troppo mentre blotti il gel si deforma le proteine si blottano male in più vedo anche delle bolle d'aria

2. non demoralizzarti i gel precast sono pessimi io li usavo in germania nella povera italia me li facevo da solo e andavano sempre bene!
3 per testare gli estratti prendi il 2 (quelli massiccio) e caricalo in più line vedi se viene uniforme (ripeto colora il gel non fare il blot)
4 hai spipettato nei pozzetti per pulirli, delicatamente con la p200 (50ul) almeno 10volte/line in questi precasted si formano come delle ragantele
5 quelli della PIRCE sono i migliori hanno i pozzetti rinforzati con plastica, secondo me sono gli unici decenti
6 beati voi che c'è ancora il sole qui a Napoli piove

giov.linux
Biologo Molecolare
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato



116 Messaggi

Inserito il - 09 dicembre 2008 : 08:52:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mattia.dinunzio Invia a mattia.dinunzio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche io concordo sempre con GFPina!
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