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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
 Inserito il - 22 ottobre 2008 : 09:12:58
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Ciao a tutti ragazzi Vi scrivo per una vostra opinione.
Ho cominciato a fare WB e fino al blottaggio tutto bene, ma purtroppo questo ultimo non mi riesce o mi riesce pochissimo. Nello specifico faccio correre i miei campioni in SDS-PAGE al 15% e successivamente blotto le proteine su nitrocellulosa a 110V per 90minuti in un Blotting Buffer cosi costituito: 3.1g/L di Tris, 14.4g/L di glicina e 200ml di MEOH, pH 8.3. Noto pero che le proteine a piu basso peso molecolare blottano meglio. Naturalmente metto anche l'ancoretta. secondo voi cosa puo essere??? ciao e grazie
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 11:50:28
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beh..un gel al 15% solitamente è per le proteine a basso peso molecolare..quindi credo sia logico che tu le veda meglio rispetto a quelle ad alto peso molecolare..se tu vuoi distinguere bene anche quelle devi abbassare la percentuale del gel..
cmq noi per il blotting mettiamo anche del ghiaccio e lo facciamo a 35o mA per 25 min.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 12:11:00
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secondo me trasferisci per troppo poco tempo. che proteina devi vedere, nel senso, qual è il PM? se cerca una proteina da 250 KDa difficilmente la vedi su un gel al 15%. ma come ti dicevo per me è un problema di tempi, e anche in quel caso il trasferimento di una proteina più piccola è più rapido. prova a trasferire per 3 ore a 350 mA (setta al max anche il voltaggio) e proverei anche a ridurre la % del gel.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 14:12:22
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intanto grazie. Devo cercare proteine a 55 e 42 KDa e ho trovato che la % di gel migliore per separarle è il 15. I marker inferiori a 42KDa blottano bene ma da quel PM in su vedo che una parte dei marker viene blottata ed una buona parte rimane sul gel. Le proteine che cerco poi le ritrovo dopo le incubazioni con gli AB (oltre a vederle con il rosso panceau) ma vorrei aumentare la mia effecienza di blottaggio. Altra cosa. Secondo voi quante volte si puo strippare e reincubare una nitro??
grazie mille |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 15:11:31
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io per prot di quel peso uso un 12,5..
il gel corre bene e in modo uniforme?
il sandwich è chiuso bene?
scusa la banalità delle domande..però a volte possono essere le cose più insignificanti che mandano tutto all'aria..
per lo strippaggio io faccio anche 3 volte (4 incubazioni)..dipende però da quante proteine carichi e quanto è espressa la tua prot di interesse..io alla 4° incubazione incubavo per il normalizzatore che so che era molto espresso.. |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 15:28:12
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| il gel direi che corre bene. la corsa avviene a 80V nello stacking e 120 nel running gel. vedendo il protocollo su Jove.com ho notato che usano carte da filtro piu spesse delle mie e che equilibrano il gel nel blotting buffer a T ambiente per 15 prima di montare il sandwich...cosa che io non facevo. in piu corrono senza ghiaccio e sempre con il Blotting B a T ambiente |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 16:41:58
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è importante equilibrare con il transfer sia il gel, sia la membrana, sia spugne che carta! bastano anche solo 5 minuti, certo è che se li tieni di più non fa niente. il trasferiemnto, così come la corsa, io li faccio sempre con un sistema refrigerante (equivale al ghiaccio), sennò si scalda troppo il buffer e poi il western ne è inficiato. cmq io che al momento sto lavorando su una proteina da 48 KDa, la sto correndo su un 8%...
in ogni caso gli alti PM rimarranno SEMPRE un po' sul gel, anche dopo un trasferimento ottimale che vedi col ponceau, se vai a fare il comassie sul gel ci troverai sempre un po' di marker al alto peso.
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 17:24:07
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la mia proteina è di 26 KDa, la percentuale del gel è 10%, trasferisco in camera fredda a 4 gradi con ghiaccino per 1 ora a 110 volt e a 400 mA. Mai avuto problemi.
E anche io equilibrio spugne, filtri e membrana nel transfer buffer prima di montare il sandwich. |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2008 : 18:47:05
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il fatto di blottare a 4°C serve solo a prevenire la degradazione delle proteine, quindi è sempre meglio farlo.
per quanto riguarda il tuo problema secondo me è soltanto una questione di tempo, anche se io non ho mai avuto questo problema blottando a 100 V e 400 mA a fondo scala per 1h.
prova ad aumentare il tempo, o meglio blotta a 20 V e 400 mA over night a 4°C e metti 2 strati di carta in più! |
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decesare
Nuovo Arrivato
Prov.: Chieti
Città: Chieti
22 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2008 : 13:02:21
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A volte basta una carta assorbente di un certo tipo per non avere il blottaggio.
A noi è successo.
Saluti.
Domenico |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2008 : 14:34:24
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| forse il problema sta nel fatto che non equilibravo gel e membrane (queste ultime di nitrocellulosa della Amershan). mi fa strano il fatto che separate proteine a PM molto basso con gel al 10%...a me marker a quella % non si separano sotto i 43KDa e viaggiano insieme poco sopra la linea del blu. |
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