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darkene
Utente Junior

occhi


291 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2006 : 12:33:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho bisogno di notizie sulla costruzione di librerie sottrattive per l'analisi differenziale dell'espressione genica.
grazie

Luis 22
Utente

Baricalcio

Città: Bari


755 Messaggi

Inserito il - 26 gennaio 2006 : 20:13:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luis 22  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luis 22  Invia a Luis 22 un messaggio Yahoo! Invia a Luis 22 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
IBRIDAZIONE SOTTRATTIVA


Generazione di una genoteca nella quale siano state eliminate le sequenze in comune tra i due tipi cellulari: genoteca sottrattiva di cDNA.

Obiettivo: isolamento di cDNA particolarmente rari.
Identificazione di di trascritti che sono presenti in un campione (chiamato tester), ma che sono assenti in un altro campione (chiamato driver). Esempio: il driver deriva da cellule di un individuo malato di cui si vogliono identificare i geni che non vengono espressi, il driver deriva da cellule normali.

-Estrazione RNA poli(a)+ da entrambi i campioni (tester e driver) e produzione di cDNA da entrambi mediante retrotrascrizione.

-marcatura del cDNA driver (in cui sono assenti alcuni trascritti) mediante biotina. La biotina ha una elevata affinità per la streptavidina, per cui tutte le molecole che contengono biotina possono essere facilmente rimosse.

-mescolamento di un largo eccesso di cDNA driver marcati con i cDNA tester. Tale miscela viene sottoposta a denaturazione e successiva rinaturazione.

-ibridizzano: driver-driver e ibridi driver-tester tra i trascritti presenti in entrambi i campioni. Poiché i filamenti derivanti da cDNA driver contengono la biotina possono essere facilmente rimossi utilizzando la straptavidina. I cDNA derivanti da trascritti presenti solo nel tester ed assenti nel driver non troveranno molecole complementari con cui ibridarsi.
I cDNA del tester che non si sono ibridati con cDNA driver perché il corrispondente gene non è espresso nella popolazione driver, e che quindi non sono stati sottratti alla popolazione di molecole, vengono utilizzati per produrre una library sottrattiva di cDNA mediante l’aggiunta di adattatori e la ligazione in un vettore.

La genoteca sottrattiva viene sottoposta a screening differenziale utilizzando sonde provenienti da differenti tipi cellulari.

Svantaggi: richiede una quantità abbastanza elevata di mRNA.


PS= se vuoi posso anche fornirti una immagine molto chiara.



La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)&
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darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 14:59:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie mille, sei stato chiarissimo!
se mi dai anche l'immagine é ancora meglio!
cià!
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Luis 22
Utente

Baricalcio

Città: Bari


755 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 15:49:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luis 22  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luis 22  Invia a Luis 22 un messaggio Yahoo! Invia a Luis 22 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando



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