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Discussione |
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rhosellina
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
 Inserito il - 15 novembre 2008 : 14:49:05
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salve a tutti, sono da poco iscritta a questo forum...
Dovrei fare un clonaggio di un inserto nel vettore pCR2.1-TOPO utilizzando il kit Topo TA cloning Kit (Invitrogen).so che il vettore ha una coda di oligo T al 3' e l'inserto una coda di poliA.
chi mi saprebbe spiegare il meccanismo con cui la topoisomerasi I di Vaccinia virus legata alle estremità del vettore linearizzato, riesce a legare l'inserto (che ha la coda di poliA aggiunta dalla Taq)?? So che è legata ad una T ad entrambe le estremità del vettore linearizzato. Il fatto che ci sia una coda di poliA legata al vettore garantisce il clonaggio direzionale??
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 15:43:05
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Welcome in molecularlab show
The plasmid vector (pCR®II-TOPO® or pCR®2.1-TOPO®) is supplied linearized
with:
• Single 3´-thymidine (T) overhangs for TA Cloning®
• Topoisomerase I covalently bound to the vector (referred to as "activated"
vector)
Taq polymerase has a nontemplate-dependent terminal transferase activity that
adds a single deoxyadenosine (A) to the 3´ ends of PCR products. The linearized
vector supplied in this kit has single, overhanging 3´ deoxythymidine (T)
residues. This allows PCR inserts to ligate efficiently with the vector.
Topoisomerase I from Vaccinia virus binds to duplex DNA at specific sites and
cleaves the phosphodiester backbone after 5#8242;-CCCTT in one strand (Shuman,
1991). The energy from the broken phosphodiester backbone is conserved by
formation of a covalent bond between the 3#8242; phosphate of the cleaved strand and
a tyrosyl residue (Tyr-274) of topoisomerase I. The phospho-tyrosyl bond
between the DNA and enzyme can subsequently be attacked by the 5#8242; hydroxyl
of the original cleaved strand, reversing the reaction and releasing topoisomerase
Immagine:
59,66 KB
The Taq polymerase does not add oligo A ,but only one of this |
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rhosellina
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 17:00:19
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
Welcome in molecularlab show
The plasmid vector (pCR®II-TOPO® or pCR®2.1-TOPO®) is supplied linearized
with:
• Single 3´-thymidine (T) overhangs for TA Cloning®
• Topoisomerase I covalently bound to the vector (referred to as "activated"
vector)
Taq polymerase has a nontemplate-dependent terminal transferase activity that
adds a single deoxyadenosine (A) to the 3´ ends of PCR products. The linearized
vector supplied in this kit has single, overhanging 3´ deoxythymidine (T)
residues. This allows PCR inserts to ligate efficiently with the vector.
Topoisomerase I from Vaccinia virus binds to duplex DNA at specific sites and
cleaves the phosphodiester backbone after 5#8242;-CCCTT in one strand (Shuman,
1991). The energy from the broken phosphodiester backbone is conserved by
formation of a covalent bond between the 3#8242; phosphate of the cleaved strand and
a tyrosyl residue (Tyr-274) of topoisomerase I. The phospho-tyrosyl bond
between the DNA and enzyme can subsequently be attacked by the 5#8242; hydroxyl
of the original cleaved strand, reversing the reaction and releasing topoisomerase
Immagine:
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The Taq polymerase does not add oligo A ,but only one of this
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rhosellina
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 17:01:21
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| ...lo avevo gia' letto.thanks...ma non l'ho trovato molto chiaro ed esauriente.. |
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rhosellina
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 17:03:47
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la sequenza ccctt riconosciuta dalla topoisomerasi è quella dunque presente sul vettore cui è legata?? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 20:04:02
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ok,
la coda non ce l ha ne il vettore ne l inserto,ma hai solo una A terminale messa dalla Taq e la T al 5' del tuo vettore
la sequenza ccctt si e' quella riconosciuta dalla topoisomerasi I e si trova sul vettore ossia legato covalentemente con un legame fosfodiestere dell ultima T,In seguito all’aggiunta di un inserto con estremità 3’ coesive di adenina, l’enzima catalizza la saldatura delle due estremità. |
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rhosellina
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 22:06:05
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2008 : 11:14:19
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| occhio che non tutte le taq aggiungono le A alla fine dell'amplificato |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2008 : 11:47:30
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| be infatti,ma anche quelle che hanno questa attivita' terminal transferasica non l attaccano a tutti i frammenti ...se non ricordo male tipo al 70% (alemno la mia Taq eppendorf) |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2008 : 12:08:00
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ma almeno ti danno la possibilità di vedere colonie.... metti che delusione non osservare colonie positive dopo aver clonato un frammento amplificato con una pfx...
un'altra considerazione se proprio vogliamo dirla tutta... le A aggiunte dalla taq sono facilmentissimamente degradabili, quindi conviene ligare il prodotto di PCR "fresco", o se datato aggiungere taq e dATP e una decina di minuti alla temperatura di extension ottimale della taq. |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2008 : 12:13:09
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Citazione:
Messaggio inserito da morgan79
un'altra considerazione se proprio vogliamo dirla tutta... le A aggiunte dalla taq sono facilmentissimamente degradabili, quindi conviene ligare il prodotto di PCR "fresco", o se datato aggiungere taq e dATP e una decina di minuti alla temperatura di extension ottimale della taq.
interesting |
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clonaggio nel vettore pCR2.1-TOPO
Didattica
