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 Biologia Molecolare
 clonaggio nel vettore pCR2.1-TOPO
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rhosellina
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Inserito il - 15 novembre 2008 : 14:49:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rhosellina Invia a rhosellina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
salve a tutti, sono da poco iscritta a questo forum...
Dovrei fare un clonaggio di un inserto nel vettore pCR2.1-TOPO utilizzando il kit Topo TA cloning Kit (Invitrogen).so che il vettore ha una coda di oligo T al 3' e l'inserto una coda di poliA.
chi mi saprebbe spiegare il meccanismo con cui la topoisomerasi I di Vaccinia virus legata alle estremità del vettore linearizzato, riesce a legare l'inserto (che ha la coda di poliA aggiunta dalla Taq)?? So che è legata ad una T ad entrambe le estremità del vettore linearizzato. Il fatto che ci sia una coda di poliA legata al vettore garantisce il clonaggio direzionale??

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2008 : 15:43:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Welcome in molecularlab show

The plasmid vector (pCR®II-TOPO® or pCR®2.1-TOPO®) is supplied linearized
with:
• Single 3´-thymidine (T) overhangs for TA Cloning®
• Topoisomerase I covalently bound to the vector (referred to as "activated"
vector)
Taq polymerase has a nontemplate-dependent terminal transferase activity that
adds a single deoxyadenosine (A) to the 3´ ends of PCR products. The linearized
vector supplied in this kit has single, overhanging 3´ deoxythymidine (T)
residues. This allows PCR inserts to ligate efficiently with the vector.
Topoisomerase I from Vaccinia virus binds to duplex DNA at specific sites and
cleaves the phosphodiester backbone after 5#8242;-CCCTT in one strand (Shuman,
1991). The energy from the broken phosphodiester backbone is conserved by
formation of a covalent bond between the 3#8242; phosphate of the cleaved strand and
a tyrosyl residue (Tyr-274) of topoisomerase I. The phospho-tyrosyl bond
between the DNA and enzyme can subsequently be attacked by the 5#8242; hydroxyl
of the original cleaved strand, reversing the reaction and releasing topoisomerase

Immagine:

59,66 KB

The Taq polymerase does not add oligo A ,but only one of this


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rhosellina
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Inserito il - 15 novembre 2008 : 17:00:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rhosellina Invia a rhosellina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio

Welcome in molecularlab show

The plasmid vector (pCR®II-TOPO® or pCR®2.1-TOPO®) is supplied linearized
with:
• Single 3´-thymidine (T) overhangs for TA Cloning®
• Topoisomerase I covalently bound to the vector (referred to as "activated"
vector)
Taq polymerase has a nontemplate-dependent terminal transferase activity that
adds a single deoxyadenosine (A) to the 3´ ends of PCR products. The linearized
vector supplied in this kit has single, overhanging 3´ deoxythymidine (T)
residues. This allows PCR inserts to ligate efficiently with the vector.
Topoisomerase I from Vaccinia virus binds to duplex DNA at specific sites and
cleaves the phosphodiester backbone after 5#8242;-CCCTT in one strand (Shuman,
1991). The energy from the broken phosphodiester backbone is conserved by
formation of a covalent bond between the 3#8242; phosphate of the cleaved strand and
a tyrosyl residue (Tyr-274) of topoisomerase I. The phospho-tyrosyl bond
between the DNA and enzyme can subsequently be attacked by the 5#8242; hydroxyl
of the original cleaved strand, reversing the reaction and releasing topoisomerase

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The Taq polymerase does not add oligo A ,but only one of this

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rhosellina
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Inserito il - 15 novembre 2008 : 17:01:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rhosellina Invia a rhosellina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...lo avevo gia' letto.thanks...ma non l'ho trovato molto chiaro ed esauriente..
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rhosellina
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15 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2008 : 17:03:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rhosellina Invia a rhosellina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la sequenza ccctt riconosciuta dalla topoisomerasi è quella dunque presente sul vettore cui è legata??
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2008 : 20:04:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok,
la coda non ce l ha ne il vettore ne l inserto,ma hai solo una A terminale messa dalla Taq e la T al 5' del tuo vettore
la sequenza ccctt si e' quella riconosciuta dalla topoisomerasi I e si trova sul vettore ossia legato covalentemente con un legame fosfodiestere dell ultima T,In seguito all’aggiunta di un inserto con estremità 3’ coesive di adenina, l’enzima catalizza la saldatura delle due estremità.


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rhosellina
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15 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2008 : 22:06:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rhosellina Invia a rhosellina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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morgan79
Utente Junior

insuperabile

Prov.: Bari


143 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2008 : 11:14:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di morgan79  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di morgan79 Invia a morgan79 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
occhio che non tutte le taq aggiungono le A alla fine dell'amplificato

il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2008 : 11:47:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
be infatti,ma anche quelle che hanno questa attivita' terminal transferasica non l attaccano a tutti i frammenti ...se non ricordo male tipo al 70% (alemno la mia Taq eppendorf)


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morgan79
Utente Junior

insuperabile

Prov.: Bari


143 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2008 : 12:08:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di morgan79  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di morgan79 Invia a morgan79 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma almeno ti danno la possibilità di vedere colonie.... metti che delusione non osservare colonie positive dopo aver clonato un frammento amplificato con una pfx...
un'altra considerazione se proprio vogliamo dirla tutta... le A aggiunte dalla taq sono facilmentissimamente degradabili, quindi conviene ligare il prodotto di PCR "fresco", o se datato aggiungere taq e dATP e una decina di minuti alla temperatura di extension ottimale della taq.

il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2008 : 12:13:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da morgan79


un'altra considerazione se proprio vogliamo dirla tutta... le A aggiunte dalla taq sono facilmentissimamente degradabili, quindi conviene ligare il prodotto di PCR "fresco", o se datato aggiungere taq e dATP e una decina di minuti alla temperatura di extension ottimale della taq.



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