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silvietta82
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 19 novembre 2008 : 23:31:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di silvietta82 Invia a silvietta82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao qualcuno sa spiegarmi come funziona questo test? Io ho capito che fornisco il substrato e ATP marcato con P32 e se la chinasi è attiva ilsuo substrato verrà marcato con la radioattività...ma mi manca qualche passaggio..nell'esemipio che sto studiando si trasfettano le COS con la chinasi (chinasi-flag) che voglio testare...non capisco come da qui si arriva poi al blot...aiutooo!

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 19 novembre 2008 : 23:49:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, se tu metti ATP radioattivo, quando la chinasi fosforila la proteina userà l'ATP radioattivo e quindi il substrato diventerà radioattivo.

Dopo aver lasciato agire la kinasi vai a recuperare il tuo substrato e a valutarne la radioattività. Questo è un indice indiretto dell'attività della kinasi, perchè più la kinasi è attiva più il substrato diventerà radioattivo.

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silvietta82
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 20 novembre 2008 : 14:13:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di silvietta82 Invia a silvietta82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, quindi per recuperare il substrato immunoprecipito con Ab contro il substrato, faccio corsa su gel, western blot e autoradiografia? Grazie mille già per il precedente aiuto!
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 20 novembre 2008 : 15:38:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, quello è un modo. Ovviamente potresti anche farlo in altri modi, chessò, tramite cromatografia, oppure semplicemente fare un estratto proteico e fare un western blot, insomma dipende dai casi.

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