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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 21 novembre 2008 : 13:01:13
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Ho cominciato le mie prime esperienze con la western blot, e naturalmente sono cominciati i casini, come mi era parso di capire per quelli che già masticano questa metodica.
Avrei in questo caso però la necessità di sapere come o dove posso determinarmi il peso molecolare di VEGF e i suoi recettori VEGF R1, VEGF R2 e VEGF R3.
Mi hanno suggerito di cercare nei lavori, ma vuoi per la scarsità del mio inglese, vuoi per la mia imbranataggine visto che è la prima volta che mi avvicino a questo mondo delle proteine non ci capisco gran che.
Potete aiutarmi? Vi ringrazio fin da ora.
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 22:55:30
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il peso delle mie bande in genere lo calcolo con un programma sul pc  ...cioè. se voglio esattamente sapere se una banda corrisponde alla proteina che cerco (di cui logicamente so il PM), calcolo la distanza della banda dal marker, poi metto tutti i dati nel programma (compresi i PM del marker) e lui mi dice qual è il PM della banda
comunque io in genere faccio affidamento al data sheet dell'anticorpo... |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 11:31:52
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Grazie a tutti, soprattutto a domi84, perchè era proprio ciò che in quel momento stavo cercando. Non è finita qua....
Dopo aver visto che il mio VEGF pesa 148096.48 ( presumo dalton e non kilodalton, giusto?) ho scoperto che quando faccio un western, non è che mi devo aspettare la banda della mia proteina in corrispondenza del suo peso molecolare,ma può essere completamente diversa perchè dipende dalla corsa. Ma allora, se il data sheet dell'anticorpo non mi dice quale sarà la banda come faccio io a sapere se quello che vedo è proprio ciò che sto cercando o magari che so un'aspecifico? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 13:25:16
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a) Usa un controllo positivo e uno negativo.
b) Cerca in letteratura. Mi sembra strano che nessuno abbia mai fatto un western per VEGF-R!
Ok, la banda può non essere al peso esatto della tua proteina ma non sarà incredibilmente lontana (cioè se pesa 148kDa, non la troverai a 10 kDa) |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 14:18:22
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| Ma è tutto così empirico? Già mi sembra di vedere un'infinità di variabili, ci si aggiunge che la banda da me attesa non è detto che sia quella... aggiungi il fatto che i campioni sono preziosissimi e la quantità è poca...ahhhhh!!! |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 15:11:46
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Scusa chick, anzi scusate tutti il mio momento di sconforto mentale.
Torniamo a noi. Per controllo positivo cosa intendi? I miei campioni erano rappresentati da lisati proteici di tumori neuroendocrini e dovevo vedere cosa ne veniva fuori, come controllo positivo cosa ci metto? Devo trovarmi da qualche parte il mio antigene e metterlo nel western? E come controllo negativo? Cosa metto un tessuto che so non avere quell'antigene o metto H2O? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 15:55:13
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Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Citazione:
Messaggio inserito da Iside
il peso delle mie bande in genere lo calcolo con un programma sul pc ...
Mmm...intendi un foglio excel (o calc ) ?
no, con graphpad prism |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 16:28:20
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Citazione:
Devo trovarmi da qualche parte il mio antigene e metterlo nel western? E come controllo negativo? Cosa metto un tessuto che so non avere quell'antigene o metto H2O?
Io metterei un tessuto che non esprime il tuo antigene, in modo da vedere se l'anticorpo lega aspecificamente altra roba. Se vuoi puoi anche mettere acqua e lì si spera di non vedere nulla.
Non ho la più pallida idea della distribuzione del VEGF però, quindi non ti so indicare che tessuto prendere
Citazione:
Per controllo positivo cosa intendi? I miei campioni erano rappresentati da lisati proteici di tumori neuroendocrini e dovevo vedere cosa ne veniva fuori, come controllo positivo cosa ci metto?
In realtà il controllo positivo ti servirebbe solo nel caso in cui non vedessi alcuna banda. In quel caso trova un tessuto o delle cellule che sicuramente esprimono VEGF. Se però i tuoi campioni ti danno già una banda puoi lasciar perdere il controllo positivo. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2008 : 17:16:45
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Beh cin hai già capito tutto del WB! Il fatto è che le variabili sono davvero tante.
Il peso molecolare "calcolato" può essere diverso dal peso molecolare "apparente" che vedi in WB.
Innanzitutto le proteine possono andare incontro a modificazioni post-traduzionali, quindi il peso è diverso da quello calcolato dalla sequenza aminoacidica.
Poi puoi avere diverse varianti di splicing, che possono anche essere diverse nei vari tessuti, quindi nel tuo tessuto in studio puoi avere una banda ad un PM diverso rispetto ad un tessuto che usi come controllo.
Per questo è importante vedere cosa dicono in letteratura. Se ci sono già studi sul tessuto che devi analizzare.
Comunque un ottima fonte di informazione è anche al data sheet dell'anticorpo, di solito sono anche citati alcuni lavori. Può darsi che sul data sheet ti dica anche il peso molecolare apparente visualizzato in WB (non sempre!).
Puoi anche cercare informazioni guardando il data sheet di altri anticorpi, ma attenta che il peso molecolare apparente può variare.
Ad es. Abcam ne ha molti:
http://www.abcam.com/index.html?t=112&pt=1&c=343
Un sito interessante per trovare "tutti" o quasi gli anticorpi in commercio è: Exact Antigen
Li ho trovato anche una review su alcuni anticorpi per VEGF: http://www.exactantigen.com/review/vegf.html
Riguardo i controlli:
un controllo positivo come dice chick80 è un tessuto che sicuramente esprime il tuo antigene, magari può essere utile anche per avere un'idea se non hai mai provato l'anticorpo e non vuoi sprecare i tuoi campioni. Puoi fare anche una prova prima con il controllo.
I controlli negativi possono essere vari:
- tessuto che sicuramente non esprime il tuo antigene (anche se non si può mai dire che non lo esprima, magari scopri di si!)
- l'H2O io non la userei, anche se li non dovresti vedere sicuramente nulla (altrimenti è successo qualcosa di veramente strano!)
- lisato incubato solo con l'anticorpo secondario senza il primario, ti serve per vedere se il secondario da cross-reattività che può causare aspecifici
- nel caso l'anticorpo sia stato fatto utilizzando un peptide e se hai il peptide ovviamente, puoi preincubare l'anticorpo con il peptide in questo caso l'anticorpo si lega al peptide e non si può più legare al campione
per ora mi vengono in mente questi.
Ok adesso immagino di averti ho fatto ancora più confusione |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2008 : 15:02:53
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Grazie mille ragazzi a tutti,non mi avete fatto più confusione, anzi siete stati chiarissimi, ma non pensiate che sia finita qua...ne ho in serbo di cose da chiedervi.... ho anche una piccola cosa da dirvi e che forse sapete già, ma che potrebbe esservi utile , ora però devo scappare a prendere mio figlio a scuola, domani apro una nuova discussione in merito.
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roselady
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: napoli
119 Messaggi |
Inserito il - 09 gennaio 2009 : 18:52:16
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| ragazzi io ho fatto una cromatografia e devo calcolare il peso molecolare delle mie proteine dopo un saggio di Bradford...ma come si fa? Devo guardare i valori nel grafico di excel..e ,se si,quali??? sono nello sconforto piu totale...spero ke qualcuno mi possa aiutare...grazie |
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Giulietta_BCM
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2010 : 11:09:09
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| Iside mi potresti spiegare come fai a calcolare il pm della proteina con graphpad prism ! io l'ho appena scaricato e non so dove mettere le mani ! non mi apre nemmeno i file! grazie |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2010 : 14:43:59
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Citazione:
Messaggio inserito da Giulietta_BCM
Iside mi potresti spiegare come fai a calcolare il pm della proteina con graphpad prism ! io l'ho appena scaricato e non so dove mettere le mani ! non mi apre nemmeno i file! grazie
Per favore, come esplicitamente scritto nel Regolamento che ti invito a leggere, non duplicare le discussioni anche se in sezioni diverse del forum.
Per la tua domanda si continua qua: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=19203 |
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Discussione |
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come determinare il p. molecolare di una proteina?
Didattica
