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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
 Inserito il - 21 novembre 2008 : 13:56:55
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Secondo voi con questo tipo di PCR mutagenesi é possibile introdurre circa 20 bp in un vettore?
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il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 22:54:22
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se non ho capito male,
si perche' no,l importante che i tuoi primers siano se non sbaglio intorno alle 30-35 bp, li disegni continuando sul vettore e che la mutazione sia pressocche' al centro
io sinceramente mi sto trovando non malissimo
PS:se vuoi un consiglio,se puoi cerca di inserire la mutazione in un sito che ti crea o ti elimina un sito di restrizione ti servira' per lo screening senza ogni volta mandare la sequenza |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 08:32:13
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| ci avevo già pensato, ma poichè si tratta di modificare un promotore ci devo andare cauto. GIà mi hai dato una buona notizia, il fatto che non devo procedere con l'overlapping è già un buon guadagno di tempo |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 09:26:55
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| Un altra cosa e' che' lo devi far stare parecchio con DpNI ...da protocollo ti dice un ora ,ma tu lascialo stare anche 2 o 3 ore a 37°C ,perche' io mi son fregato una settimana in piu' per questo |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 09:56:49
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| io inverce mi son sempre trovato bene con un'ora di incubazione, forse dipende dall'età dell'enzima |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 10:43:12
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mha,allora diciamo che e' a c**o
perche' il mio e' stratagene comprato circa 4 mesi fa |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 13:08:20
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| io uso il mio DpnI della roche e non mi ha mai dato fregature, e sta lì da prima di me, ossia più di due anni |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 17:24:12
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a si ma anch io per le altre che ho fatto,pero' con 2 sono rientrato in quel 20% di inefficienza detta anche dal kit
In addition, the QuikChange site-directed mutagenesis
system requires no specialized vectors, unique restriction sites, or multiple
transformations. This rapid four-step procedure generates mutants with
greater than 80% efficiency
e quindi da troubleshooting
Allow sufficient time for the Dpn I to completely digest the parental template;
repeat the digestion if too much DNA template was present.
Quindi un fattore limitante potrebbe essere questo,ma ovviamente loro ti dicono di metterne di piu' e non di farlo stare del tempo in piu' |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 19:10:36
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cmq la cosa più importante è che posso introdurre circa 20 bp con questa strategia, volevo fare di tutto per evitare l'overlapping
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il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
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Discussione |
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PCR mutagenesi con DpnI
Didattica
