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valentina72
Nuovo Arrivato




23 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:25:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valentina72 Invia a valentina72 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
conoscete un kit per estrarre proteine da tessuti in paraffina o comunque da tessuti?
grazie...

Vale

Tat
Nuovo Arrivato


Città: Milano


33 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2006 : 22:27:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Tat Invia a Tat un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
NO mi dispiace non conosco nessun kit...hai provato a vedere sul sito www.protocol-online.org ?
Prova e in bocca al lupo
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 00:15:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Con il Trizol della Sigma mi sembra si possano anche estrarre le proteine oltre a DNA e RNA.

Se vuoi posso anche dirti come estrarre le proteine senza kit, e' molto semplice.

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valentina72
Nuovo Arrivato




23 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 14:38:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valentina72 Invia a valentina72 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Con il Trizol della Sigma mi sembra si possano anche estrarre le proteine oltre a DNA e RNA.

Se vuoi posso anche dirti come estrarre le proteine senza kit, e' molto semplice.



Saresti molto gentile....
Non ho mai "maneggiato" tessuti e tantomeno in paraffina quindi non ho idea di che quantità possa servire. Io vorrei poi fare dei Western....

Vale
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ros
Nuovo Arrivato

Prov.: Bologna


1 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 19:53:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ros Invia a ros un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao...
io conosco l'OMNIzol perchè ci estraggo RNA sia dalle cellule che dai tessuti (però i miei non sono in paraffina) ma è possibile estrarre anche DNA e proteine. Ti segnalo il sito della ditta sperando che possa esserti d'aiuto
www.euroclone.net
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data
Nuovo Arrivato

airplane_canvas

Prov.: Torino
Città: Torino


89 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 20:11:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di data  Invia a data un messaggio ICQ  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di data Invia a data un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se esiste un kit per estrarre proteine sensatamente da tessuti inclusi in paraffina ne sarei molto felice (ai topastri attualmente estirpo prima un qualsiasi tessuto della panza che proliferi prima di perfonderli...).

http://www.medito.eu.org/vodka/odierno
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 21:30:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Una curiosita' data... senza andare in particolari troppo scabrosi... riesci a perfondere i topi anche se prima gli togli pezzi qua e la? Non viene un pasticcio?

=====

Per valentina:

ti dico quello che facevo io per fare western da tessuti (pero non erano in paraffina, ma fresh frozen, quindi magari c'e' qualche step in piu da fare)

Allora, lavorando sempre in ghiaccio:

- mettere il tessuto in una eppendorf (o cmq in una provetta abbastanza grande da contenerlo), aggiungere cocktail di inibitori proteasi/fosfatasi (vedi sotto) + agente di lisi e omogenare con il sonicatore (io facevo 3 passaggi da 10" a potenza media). Io per un ipotalamo di ratto mettevo 500 ul di cocktail di lisi, ovviamente poi aggiusti un po' il volume a seconda della quantita' di tessuto.

- lasciare 15' in ghiaccio

- centrifugare 15' 12000 rpm a 4 gradi

- trasferire il surnatante contenente le proteine in un altra provetta (tenere il pellet, non si sa mai... puoi riestrarre da li' in caso qualcosa vada storto)

- dosare le proteine con il metodo che piu ti piace (Bradford e' il migliore)

====

Cocktail di inibitori: lo puoi comprare gia' pronto o farlo tu come segue

Per 1 ml :

2 ul di EDTA 500 mM
10 ul PMSF hydrocloride 50 mM
10 ul Leupeptina 1ug/ml
5 ul Pepstatina A 2ug/ml
2 ul Aprotinina 1ug/ml
2 ul Antipaina 1ug/ml
1 ul Benzamidina 1mg/ml
2 ul Chimostatina 1 mg/ml
5 ul Na Vanadato 200 mM
5 ul NaF 200 mM

Portare a volume con PBS senza Ca++ e Mg++ (in alternativa TBS)

L'agente di lisi e' NP-40 (Igepal) all'1%


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data
Nuovo Arrivato

airplane_canvas

Prov.: Torino
Città: Torino


89 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 21:41:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di data  Invia a data un messaggio ICQ  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di data Invia a data un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Viene un pasticcio cmq visto che sono alle prime armi :) Cmq in realtà prendere la milza prima di aprire il torace è fattibile. Altro non ho provato (che il fegato mi serve lì per vederlo cambiar colore...).

http://www.medito.eu.org/vodka/odierno
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valentina72
Nuovo Arrivato




23 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 23:17:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valentina72 Invia a valentina72 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

............Cocktail di inibitori: lo puoi comprare gia' pronto o farlo tu come segue

Per 1 ml :

2 ul di EDTA 500 mM
10 ul PMSF hydrocloride 50 mM
10 ul Leupeptina 1ug/ml
5 ul Pepstatina A 2ug/ml
2 ul Aprotinina 1ug/ml
2 ul Antipaina 1ug/ml
1 ul Benzamidina 1mg/ml
2 ul Chimostatina 1 mg/ml
5 ul Na Vanadato 200 mM
5 ul NaF 200 mM

Portare a volume con PBS senza Ca++ e Mg++ (in alternativa TBS)

L'agente di lisi e' NP-40 (Igepal) all'1%




A parte che sei bravissimo.....
Per Cocktail di inibitori non è che mi dici anche da chi comprarlo?....

Vale
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2006 : 23:37:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non l'ho mai comprato, ma questo della Sigma sembra simile a quello che ti ho scritto sopra:

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/P8340

Leggo che non ci sono chelanti, quindi probabilmente dovrai aggiungerci l'EDTA (e il NaF e NaV forse... ma sinceramente non sono sicuro a cosa servano!)

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valentina72
Nuovo Arrivato




23 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 11:20:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valentina72 Invia a valentina72 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
chick80 quanto grande sarà un ipotalamo di ratto? blèeeee
Io ho biopsie di 0,5 cm max 1 cm.....UMANE

Vale
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valentina72
Nuovo Arrivato




23 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 11:21:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valentina72 Invia a valentina72 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
chick80 grazie per le info...credo di aver trovato la persona in grado di darmi suggerimenti! grazie

Vale
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2006 : 12:11:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
un ipotalamo di ratto e' piccino... sta nel fondo di una eppendorf da 1.5 ml!

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