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andrea78
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 03 dicembre 2008 : 19:01:40
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Ciao a tutti.Ho bisogno di un consiglio: Sto lavorando con la quantificazione assoluta in real-time PCR. Ho clonato la mia sequenza target in un vettore. Con questi cloni faccio la serie di diluizioni per avere 10^7, 10^6, 10^5, 10^4 n°di molecole/ng di RNA e, in base ai Ct ottenuti, mi faccio la curva standard , su cui vado ad interpolare i Ct dei miei campioni sconosciuti e sapere la loro quantità come n° di trascritti/ng di RNA.Fino ad oggi tutto bene. Finiti i miei cloni li ho dovuti ripreparare. Pertanto ho rimesso in cultura i batteri, ho fatto la miniprep, ho misurato accuratamente la concentrazione dei plasmidi estratti allo spettrofotometro e ho rifatto le diluizioni seriali. per verificar il tutto ho comparato le nuove diluizioni con le vecchie diluizioni, usando queste per fare la curva standard e considerando le nuove diluizioni come campioni sconosciuti. I risultati dovrebbero coincidere ma in realtà i nuovi cloni amplificano in ritardo con un Ct di differenza rispetto ai vecchi.. Escludendo la non corretta lettura allo spettrofotometro , quindi considerando corrette le diluizioni, quale potrebbe essere secondo voi la causa di tutto ciò?...
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Real-time PCR quantificazione assoluta
Didattica
