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milly08
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 10 dicembre 2008 : 19:29:16
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Qual'è la concentrazione ottimale di glicerolo, Dmso e triton da aggiungere per cercare di aumentare la specificità di Pcr?
Nel mio caso per un amplificato di 450bp, ho già verificato di aver minori aspecifici per Tm basse e bassa concentrazione salina, ma poichè in quest'ultimo caso la mia banda era molto debole, ho deciso di usare una concentrazione di Cloruro magnesio pari a 3.5mM.
Essendo alle prime armi, mi chiedevo che range di concentrazioni posso usare per i suddetti additivi? e poi se potete consigliarmi qualcos'altro, fate pure
Cmq grazie e complimenti a tutti. perchè è un forum molto utile
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2008 : 00:50:26
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Ciao milly08, benvenuta in molecularlab! 
DMSO e Glicerolo si usano a concentrazioni di 5-10%
Il triton è meno utilizzato e non so la concentrazione dovrei cercarla!
BSA si usa ad una concentrazione di 0.1-0.8 ug/uL.
Betaina ad una concentrazione 0,5-5M.
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2008 : 11:04:24
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| Scusate l'ignoranza, ma c'è nessuno che mi potrebbe spiegare il ruolo di tutti gli additivi di cui state parlando nella PCR? Io fino ad ora avevo sentito parlare solo della BSA... |
 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2008 : 12:52:09
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Servono essenzialmente per aumentare la resa e la specificità della PCR.
Credo che i meccanismi precisi non siano noti, ma in generale funzionano diminuendo la costante dielettrica del mezzo e rendendo più semplice la rottura dei legami H o comunque rendendo in qualche modo più facile l'apertura della doppia elica.
Sulla betaina vedi anche: Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.
Comunque, giusto per precisare, provane uno alla volta, aggiungerne più di uno o a concentrazioni troppo alte potrebbe anche inibire la reazione! |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2008 : 14:13:54
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| Grazie mille chick...Non si smette mai di imparare... |
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