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debo
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 15 dicembre 2008 : 14:10:31
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Ciao a tutti,ho un piccolo problemino con delle cellule che non si vogliono trasfettare....credo che il problema oltre alle cellule sia anche il costrutto in se ad essere un po' rognosetto...Mi è giunta voce che esisterebbe un nuovo kit di trasfezione, non a base liposomica, ma che si basa sullo stesso principio di avvolgere il DNA da inserire nella cellula, in questo caso però con una capsula simile a quella virale, aumentando di gran lunga l'efficienza di trasfezione senza però dover utilizzare costrutti virali....
Visto che per ottenere questi costrutti ci abbiamo impiegato molto tempo, rifarli per ottenere dei costrutti virali sarà proprio l'ultima spiaggia....Ho provato mille diversi Kit di trasfezione, perfino con i sali e con l'elettroporazione....non so più che fare....
Qualcuno di voi ha sentito parlare di questo nuovo kit, lo avete mai utilizzato???E sapete dirmi dove trovarlo???
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2008 : 15:34:28
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Io ho sentito parlare molto bene del nucleofector dell'amaxa, che usa lo stesso principio dell'elettroporazione migliorata in alcune caratteristiche per avere un'efficienza e durata della transfezione molto maggiore... non so, magari ti potrebbe interessare.
Comunque, non so la tua preparazione e tutti i tentativi che hai fatto, ma nella maggioranza dei casi che ho visto o sentito parlare, la problematica si è risolta con degli accorgimenti molto banali, piccole differenze nei protocolli. Dovresti provare ad escludere questi prima di inoltrarti in tecniche più difficili. Non vedo perché il costrutto dovrebbe essere difficile da transfettare dato che si riesce ad elettroporare cellule con vettori di 23.000 basi, come nel mio caso, o anche più con un'ottima efficienza... Non saprei, la mia è solo una valutazione preliminare non conoscendo il tuo laboratorio e la tua relativa conoscenza.
Alcune delle caratteristiche da tener conto per l'efficienza di trasfezione sono:
1) % confluenza delle cellule
2) tempo di piastramento
3) stato di salute delle cellule
4) transfezione con o senza siero
5) quantità di DNA da transfettare
6) tempi di incubazione
7) mezzo in cui prepari la mix per la transfezione
8) shock termici
9) volume di mezzo usato per la transfezione
10) tempo che intercorre tra la transfezione e la misurazione dell'efficienza
etc etc
Per alcune cellule potrebbero essere fondamentali i punti 1 e 2 di quelli elencati, mentre per altre cellule sono fondamentali i punti 3 e 6 etc etc.
In bocca al lupo
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debo
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2008 : 17:28:15
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Grazie mille per la risposta.
Effettivamente io non ho molta esperienza in campo cellulare....ma tutti i suggerimenti che mi hai descritto sono stati tentati...con risultati non soddisfacenti...Credo sia il costrutto un po' fastidioso, oltre al tipo cellulare , semplicemente per il fatto che trasfettando le stesse cellule con un altro costrutto che esprime una proteina citosolica fusa alla GFP, nelle stesse condizioni utilizzate per il mio costrutto difficile, nel primo caso ho molte più cellule trasfettate che nel caso del mio costrutto (costituito da circa 12kb)....
Ti ringrazio per il suggerimento
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