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plasmidesuicida
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2 Messaggi |
 Inserito il - 17 dicembre 2008 : 15:36:06
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Salve a tutti, nuova utente... pronta domanda...
Allora il mio problema paradossale è molto semplice
Sto portando avanti un esperimento di biotinilazione su cellule in coltura utilizzando la biotina (con legame ad ammine tramite ponte disolfuro) della pierce per poterle in seguito precipitare con l'utilizzo di beads coniugate con avidina. La questione è questa: il lega e la precipitazione sono settate e gli esperimenti riescono poi però per una variante del protocollo io ho BISOGNO di staccare questa biotina coniugata alle mie proteine di membrana (NdR la biotina è impermeabile alle membrane cellulari) e tutta la mia ricerca bibliografica riporta al protocollo dove per staccare questa maledetta devo utilizzare un buffer contenente MesNa che è 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium. Ora i protocolli di altri lavori parlano di concentrazioni 10, 50 massimo 100 mM. Beh a me non mi si stacca niente neanche utilizzandola 1 M !!!!
Quindi considerando che ho rispettato sia i buffer (PH compreso) che le metodiche che i tempi di incubazione e anche i materiali sono gli stessi delle pubblicazioni e ho ampiamente sperimentato i range di concentrazione... per quale arcano e recondito motivo il mio stripping non funziona???
Se c'è qualcuno che ha già esperienza in questa metodica o ne utilizza una alternativa sono in trepidante attesa di nuove idee (se poi potete aggiungere anche una reference sarebbe l'ideale così mi studio l'articolo)
Vi ringrazio in anticipo
Citazione:
Per coloro a cui sono stati donati buoni geni,è naturale un'inclinazione alla genetica Citazione:
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biotinilazione e MesNa buffer perchè non viene?
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