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Cikobiotech
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
 Inserito il - 26 dicembre 2008 : 19:35:07
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Innanzitutto vorrei fare gli auguri a tutti quelli del forum.
Allora il mio quesito è il seguente: la Taq polimerasi non presenta attività di proofreading ,ma presenta invece l'attività esonucleasica 5'-3'.Nei miei studi ho appreso che per la PCR l'attività esonucleasica 5'-3' è più dannosa che altro (se mi sbaglio correggetemi) tanto che fu introdotto l'utilizzo del frammento di Klenow , dove quest'attività esonucleasica non c'è.
Ora vorrei capire se quest'attività esonucleasica 5'-3' sia così deleterea o meno per una PCR.
E poi se è deleterea in vitro perchè non lo è il vivo(questo solo nei procarioti),visto che cmq è presente ?
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 26 dicembre 2008 : 20:27:53
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| Non vedo perché l'attività esonucleasica 3'-5' sia dannosa...L'attività viene sfruttata anche nella nick translation per ottenere sonde marcate o nella Real Time PCR...L'attività esonucleasica 5'-3' potrebbe essere dannosa perché potrebbe andare a digerire i primers appaiati agli stampi, che presentano tutti delle estremità 3' libere, peggio ancora se i primers presentano delle mutazioni da inserire nel DNA... |
 
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Cikobiotech
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
Inserito il - 26 dicembre 2008 : 20:36:23
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| Per quanto riguarda l'attività esonucleasica 3'-5' ci sono(nick translation ect.).......se come dici tu l'attività esonucleasica 5'-3' è deleterea ,perchè si usa la Taq polimerasi che ha appunto tale attività? |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 26 dicembre 2008 : 21:23:09
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| Scusami ho invertito le attività...Il frammento di Klenow ha l'esonucleasica 5'-3' come la Taq il che significa che degrada il filamento di DNA a doppia elica a partire da un'estremità 5' verso il 3', lo stesso senso della polimerizzazione, praticamente si "mangia" tutto quello che si trova davanti...L'attività 3'-5' è quella di proof-reading, quella che permette alla polimerasi di tornare indietro in caso di errore e rimuovere il nucleotide (se non ricordo male la scelta se continuare nella sintesi o tornare indietro a correggere in una polimerasi normale dovrebbe dipendere dalle energie in gioco al momento dell'appaiamento di un nuovo nucleotide, però prendi la cosa con le pinze, se ti interessa la trovi tranquillamente sul Gene VIII)...Se ci fosse questa attività il 3' libero del primer al momento dell'annealing potrebbe venir degradato e vale il discorso fatto prima... |
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Cikobiotech
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
Inserito il - 26 dicembre 2008 : 22:02:12
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| ok. Ma non riesco a capire perchè la taq polimerasi non degrada nè i primer e nè il ssDNA denaturato ,visto che hanno le estremità liberissime di essere mangiucchiate. So che praticamente si preferisce con le taq polimerasi fare un hot start o cmq unite ad anticorpi che ne inibiscono la funzione (finche non si raggiunge la temperatura di 94 C che denatura l'anticorpo). Questo il primo ciclo ma per i successivi ,come si evita che il dna e i primers vengano degradati , o sono presenti in quantità tali da ottenere cmq una PCR a efficienza alta |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 27 dicembre 2008 : 00:35:32
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| Penso che a questo punto si vada a finire su concetti di cinetica e Km...L'attività preponderante di una DNA polimerasi è quella di polimerizzazione dei nucleotidi trifosfato e quindi è l'attività che maggiormente avverà all'interno di una miscela di reazione di PCR dove l'enzima è poco e gli altri reagenti sono in largo eccesso...Non sono comunque sicuro ma penso che al di là di tutto ciò il problema si risolva a monte col fatto che l'attività esonucleasica 5'-3' sia attiva solo su dsDNA e non su ssDNA... |
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Cikobiotech
Nuovo Arrivato
37 Messaggi |
Inserito il - 27 dicembre 2008 : 15:17:42
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Ciao Schuldiner86 grazie per la risposta più che esauriente...diciamo che mi hai dato un quadro generale molto più chiaro ora. Grazie mille e auguri di buon anno! |
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Taq polimerasi nella PCR
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