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drugo77
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 12 gennaio 2009 : 17:07:50
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Ciao a tutti.
Sono un biotecnologo agro-vegetale e mi occupo di fitoplasmi, batteri patogeni parassiti obbligati di molte specie vegetali.
Ultimamente sto cercando di valutare la variabilità genetica nelle popolazioni di fitoplasmi che infettano singole piante di vite, ovvero capire se una pianta può 'ospitare' più ceppi. Per questo, ho amplificato da piante di vite malate un gene utilizzato nello studio dei fitoplasmi(rps3)e ho sequenziato, dopo clonaggio, 4 librerie geniche, ciascuna ottenuta da una pianta di vite. Allinenando le sequenze, ho individuato 8 SNPs che caratterizzano 8 potenziali 'varianti geniche' del fitoplasma infettante la vite.
Il problema è la valutazione di quanto gli errori metodologici (PCR, clonaggio e sequenziamento) abbiano influito sulla presenza di questi SNPs.
Visto che la frequenza di ogni SNPs è differente, vorrei sfruttare questo parametro per sostenere che alcuni SNPs sono probabilmente generati da errori (casuali), mentre altri non possono essere stati generati da errori (reali) e rappresentano varianti geniche del patogeno.
Non so, però, che tipo di analisi probabilistica e/o statistica dovrei applicare al problema... Mi potreste consigliare una soluzione?
ps: spero di essermi spiegato!!!!
GRAZIE A TUTTI!!!!!!!!!
Fabio
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Topogigio77
Nuovo Arrivato
Città: Milano
37 Messaggi |
Inserito il - 13 gennaio 2009 : 12:55:30
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per definizione, uno SNP per essere tale deve essere presente in almeno l' 1% della "popolazione".
altrimenti si parla solo di mutazione
io ripeterei l'esperimento per verificare o meno la presenza di quelle possibili mutazioni nelle medesime posizioni...se ricompaiono è difficiel giustificare che non lo siano, più o meno frequenti che siano.
poi analizzerei in maniera molto più semplice e rapida (SNapshot? Discriminazione allelica by Real Time PCR?) questi possibili polimorfismi su una batteria ampia di campioni, per valutarne la reale frequenza... |
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drugo77
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2009 : 12:20:45
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Grazie mille per l'aiuto!
Ti chiedo un favore... mi potresti indicare qualche reference da citare per sostenere che l'SNP per definizione deve essere identificato in almeno l'1% della popolazione?
Per quanto riguarda la ripetitività del dato... ho analizzato due librerie geniche da due PCR indipendenti, condotte usando come templato il DNA estratto dalla stessa pianta, ed ho ritrovato le stesse mutazioni (SNP?) con la stessa frequenza! Il fatto, poi, di ritrovare le stesse mutazioni in altre librerie geniche di piante diverse rafforza il sospetto che queste mutazioni siano veri SNP, in quanto rilevate in librerie geniche ottenute da campioni indipendenti (nel senso che è molto strano che la PCR introduca errori random sempre nello stesso posto...).
Per dimostrare in modo più solido che gli SNP sono reali vorrei calcolare un coefficiente che indichi la probabilità che l'errore random della PCR 'colpisca' ripetutamente nella stessa posizione nucleotidica.
Voglio usare questo approccio statistico perchè lavorare sui fitoplasmi è molto complesso, in quanto molto poco concentrati nei tessuti vegetali che infettano... abbiamo già provato la real-time per altri obiettivi (diagnosi specifica del patogeno) ma risulta veramente difficile discriminare una sola base di differenza...
Ciao e grazie
Fabio
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SNPs random o reali?
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