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Mariateresa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 10 febbraio 2006 : 21:29:30
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Ciao a tutti
settimana prossima affiancherò una ricercatrice per imparare la tecnica western blot.
ho già letto in proposito ma mi piacerebbe sapere quando viene utilizzata la tecnica (ovviamente so che viene usata per riconoscere le proteine!) magari raccontatemi le vostre esperienze
grazie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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sally007
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2006 : 13:03:28
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Io l'ho utilizzata in un lab didattico per valutare tra 2 campioni incogniti di BSA quale avesse subito danno ossidativo, valutando come marker l'introduzione di funzionalità carboniliche.Cosa ti interessa sap?
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Mariateresa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2006 : 15:24:39
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Parlami della tua tesi su cosa hai effettuato il western e cosa sei andato a val;utare in particolare, io ho delle molecole con potenziale azione antiossidante.
Grazie e scusa se ho risposto tardi ma non avevo a disposizione un PC.
Ciao |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2006 : 03:23:40
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Dunque, io stavo valutando l'azione di un fattore di crescita (TGF beta-1) su una linea neuronale.
In particolare controllavo l'attivazione per fosforilazione di alcune proteine dopo trattamento con questo GF.
Ho usato quindi anticorpi specifici per la forma fosforilata e non delle proteine target in modo da vedere l'aumento della forma fosforilata ma non della proteina totale. Il tutto veniva fatto come time-course, quindi trattando per 5, 10, 15, 30, 60 e 120' (o qualcosa di questo tipo...)
Devo dire che abbiamo ottenuto anche dei bei risultati e il Western blotting non è così male una volta che capisci un po' come
funziona il tutto. |
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Mariateresa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2006 : 16:09:18
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Ecco ancora devo capire comunque grazie!!! |
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Tat
Nuovo Arrivato
Città: Milano
33 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2006 : 16:07:20
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il western blot è un'analisi di tipo qualitativo e quantitativo che ti permette di verificare la presenza della tua proteina di interesse. Tale metodica consiste nel trasferire su una membrana di nylon, nitrocellulosa e pvdf le proteine di un estratto cellulare precedentemente separate tramite sds-page, in cui come già saprai le proteine sono cariche negativamente. L'apparato di trasferimento permette attraverso l'applicazione di un campo elettrico il passaggio delle proteine dal gel alla membrana, carica positivamente. Terminato il trasferimento che può essere O/N o breve dipende dal voltaggio applicato e dal tipo di proteine da trasferire, la membrana con le tue proteine verrà bloccata con latte o BSA. Tale passaggio impedisce all'anticorpo specifico per la tua proteina di annilarsi in maniera aspecifica sulla membrana. Una volta fatto ciò si procede con l'immunoblotting:
-incubazione con Ab I
-lavaggi per eliminare gli annealing aspecifici
-incubazione con Ab II che riconosce la porzione costante dell'Ab I e che contiene un enzima in grado di sviluppare una reazione colorata reagendo con un substrato cromogeno (ECL).
-il segnale luminoso verrà rivelato tramite esposizione della membrana ad una lastra fotografica al buio.
-la lastra verrà sviluppata come una normale fotografia e su di essa vedrai le bande corrispondenti alla tua proteine di interesse.
Spero di averti aiutato anche se in ritardo rispetto al messaggio.
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Mariateresa
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2006 : 11:16:34
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| [grazie |
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MartinaHox
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 15:32:15
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| e in che modo si leggono le bande? In particolare: potreste siegarmi come leggere e interpretare i risultati di un esperimento che usa immunoprecipitazione associata a spettrometria, ed esperimenti che usano western blotting con proteine FLAG tagged? |
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western blot
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