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Autore

Discussione

82biotec
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2009 : 16:37:04

Ciao a tutti devo allestire un costrutto plasmidico che poi tester� per delle trasfezioni per un silencing.
Ho gi� fatto dei costrutti plasmidici..ma � passato un po di tempo e volevo chiedere delle conferme/smentite.
Per ora ho terminato la fase diciamo virtuale usando il programma ApE.

Allora devo clonare la seqenza del human miR21 (clonagggio utilizzando i siti unici HindIII e SpeI).
Ho gia fatto le prove con ApE e sulla carta � tutto ok.

Ecco alcuni dati:
Inserto: h-miR21 ( me lo faccio sistetizzare gia con i siti di restrizione di cui ho bisogno)

Vettore: pMIR-Report (AMBION)...siti unici HindIII e SpeI, quindi nn dovrei avere problemi..siti unici, enzimi differenti, nn mi posso lamentare.

Quello che volevo sapere e se per il clonaggio posso inserire direttamente il mio inserto (miR21) nel pMIR-REPORTEr (ricordo che questo costrutto devo usarlo per trasfezioni)...o devo prima per forza passare per un vettore intermedio (tipo pGem o altro)?

Grazie a tutti.

Metto in allegato la mappa del vettore, � il primo, quello con la Luciferasi;)

Allegato:

pMIR-REPORTER.doc
48,61 KB

Patrizio
Moderatore

Citt�: Barcellona

1915 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2009 : 11:19:30

In genere lo passi in TA per favorire i tagli da parte degli enzimi ,quindi se i siti di restrizione si trovano molto all estremita'difficilemte taglierananno e ti converra' passare prima in TA
a meno che non te lo fai fare con siti di restrizione che abbiano una distanza utile per gli enzimi

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2009 : 12:39:41

Ciao, ho fatto un clonaggio esattamente identico al tuo e non ho avuto
troppa difficolt� (appunto perch� i siti sono gi� disegnati nell'oligo
sintetico). Secondo me non ci sono ragioni per cui passare da pGEM.

Volere libera : questa � la vera dottrina della volont� e della libert�
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

82biotec
Nuovo Arrivato

23 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2009 : 20:14:47

Si infatti..pensavo di nn passare pe pGem...prover� il clonaggio diretto.

grazie a tutti:)