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82biotec
Nuovo Arrivato



23 Messaggi

Inserito il - 29 gennaio 2009 : 16:37:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 82biotec Invia a 82biotec un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti devo allestire un costrutto plasmidico che poi testerò per delle trasfezioni per un silencing.
Ho già fatto dei costrutti plasmidici..ma è passato un po di tempo e volevo chiedere delle conferme/smentite.
Per ora ho terminato la fase diciamo virtuale usando il programma ApE.

Allora devo clonare la seqenza del human miR21 (clonagggio utilizzando i siti unici HindIII e SpeI).
Ho gia fatto le prove con ApE e sulla carta è tutto ok.

Ecco alcuni dati:
Inserto: h-miR21 ( me lo faccio sistetizzare gia con i siti di restrizione di cui ho bisogno)

Vettore: pMIR-Report (AMBION)...siti unici HindIII e SpeI, quindi nn dovrei avere problemi..siti unici, enzimi differenti, nn mi posso lamentare.

Quello che volevo sapere e se per il clonaggio posso inserire direttamente il mio inserto (miR21) nel pMIR-REPORTEr (ricordo che questo costrutto devo usarlo per trasfezioni)...o devo prima per forza passare per un vettore intermedio (tipo pGem o altro)?

Grazie a tutti.

Metto in allegato la mappa del vettore, è il primo, quello con la Luciferasi;)

Allegato: pMIR-REPORTER.doc
48,61 KB

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2009 : 11:19:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In genere lo passi in TA per favorire i tagli da parte degli enzimi ,quindi se i siti di restrizione si trovano molto all estremita'difficilemte taglierananno e ti converra' passare prima in TA
a meno che non te lo fai fare con siti di restrizione che abbiano una distanza utile per gli enzimi


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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2009 : 12:39:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, ho fatto un clonaggio esattamente identico al tuo e non ho avuto
troppa difficoltà (appunto perchè i siti sono già disegnati nell'oligo
sintetico). Secondo me non ci sono ragioni per cui passare da pGEM.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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82biotec
Nuovo Arrivato



23 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2009 : 20:14:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 82biotec Invia a 82biotec un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si infatti..pensavo di nn passare pe pGem...proverò il clonaggio diretto.

grazie a tutti:)
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