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saretta_val
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2006 : 17:55:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di saretta_val Invia a saretta_val un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti! Sono capitata qui mentre cercavo informazioni su pcr e cose del genere...spero che riuscirete ad aiutarmi..sono in piena crisi devo eseguire degli esercizi della pcr, ma non so da dove iniziare...l'esercizio prevede l'identificazione di primers sulla sequenza (e fin qui va tutto bene). Poi, però, chiede di fare un'inserzione e una delezione nell'amplicone..ad esempio nell'inserzione so che devo utilizzare dei primers interni alla sequenza con delle "code" per inserire il frammenti utilizzando 3 passaggi di pcr..qualcuno sa spiegarmi come fare?grazie mille (spero di essermi spiegata bene..)

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2006 : 02:42:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per fare un inserzione:

hai una situazione tipo


5'-----------X---------------3'


e vuoi inserire un tratto di DNA dove c'e' la X

Usi 2 coppie di primers fatte cosi:


  --->
5'------------X------------3'
           <--X
               AAABBB
          
        BBBCCC  
              X-->
5'------------X------------3'
                        <---



(nota, nel mio disegno lettere uguali sono complementari, cioe' BBB sara' complementare a BBB, ovviamente nella realta' avrai tipo CGTTGC e GCAACG)

Amplificando otterrai (fai 2 PCR separate con i 2 primers):


  
5'------------X
  ------------XAAABBB
          
e, dall'altra coppia

                  BBBCCCX-------------
                        X------------3'
                        


Ora mischi il tutto e avrai qualcosa tipo


-----------X          BBBCCCX-----------
-----------XAAABBB          X-----------


Fai un primo passaggio denaturando e aggiungendo Taq


            BBBCCCX--------
--------XAAABBB


I due filamenti saranno completati e ti daranno


--------XAAABBBCCCX--------
--------XAAABBBCCCX--------


Puoi poi amplificare il tutto con dei primer x il 5' e il 3'.


---

Per la delezione la cosa e' molto simile:

Parti da

--------XXXXXXXXX----------
--------XXXXXXXXX----------


(X e' la parte che vuoi eliminare)
Usi primer con code complementari


->
--------XXXXXXXXX----------
--------XXXXXXXXX----------
     <--
        AAA

e
              AAA
                 -->
--------XXXXXXXXX----------
--------XXXXXXXXX----------
                         <-



Otterrai


-------AAA
-------AAA

e 

       AAA-------
       AAA-------


Procedi poi come sopra!

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saretta_val
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2006 : 11:25:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di saretta_val Invia a saretta_val un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ti giuro non so come ringraziarti!!!grazieeeeeeeeeeeeeeeeee
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2006 : 13:03:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
figurati, no prob

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saretta_val
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2006 : 21:26:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di saretta_val Invia a saretta_val un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusami se ti disturbo ancora...ma sei stato così chiaro nella spiegazione..e non riesco a trovare schemi simili al tuo da altre parti..potresti indicarmi (sempre se non ti crea disturbo) come si esegue una sostituzione con PCR?se non sbaglio devo utilizzare sempre delle code di sostituzione insieme ai primers giusto? (il mio professore non è stato poi molto chiaro riguardo questo argomento..)..grazie ancora..
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 17 febbraio 2006 : 00:45:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'idea è sempre quella, basta usare primer mutati.

Ad es:

----------TGCAGCCTCA--------
----------ACGTCGGAGT--------


Vuoi mutare CG in AT ad es.

Usi primer fatti cosi:

->
----------TGCAGCCTCA-------------
----------ACGTCGGAGT-------------
        <-TGCAG CTCA
               T

               A
          ACGTC GAGT->
----------TGCAGCCTCA-------------
----------ACGTCGGAGT-------------
                               <-


In questo modo il primer sarà ancora stabilmente attaccato, ma inserirà una mutazione.

Otterrai quindi


----------TGCAGACTCA
----------ACGTCTGAGT

e

          TGCAGACTCA--------
          ACGTCTGAGT--------


Poi vai avanti esattamente come sopra x unire i due frammenti.

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saretta_val
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 17 febbraio 2006 : 08:05:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di saretta_val Invia a saretta_val un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sei un tesoro, grazie mille!!!
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 14 novembre 2006 : 17:11:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Stavo leggendo questo vecchio post perchè mi interessava e:

Citazione:
Messaggio inserito da chick80


         BBBCCCX--------
--------XAAABBB




Le sequenze complementari "BBB" quanto devono essere lunghe?
bastano 3 nucleotidi? o meglio 6? 10?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 novembre 2006 : 19:44:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hmmmm... mai fatto in pratica, ma credo che 3 siano un po' pochini.
Starei più sugli 8-10 nucleotidi, anche se ovviamente dipende anche dalla sequenza.

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