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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 04 febbraio 2009 : 13:08:40
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mi sono trovata a fissare delle cellule per immunofluorescenza con metanolo. queste cellule erano state preventivamente microiniettate con una proteina in dextran-FITC. dopo la fissazione, sono andata a guardarmi le cellule ma non sono riuscita a trovare le microiniettate, come se avessi perso la fluorescenza del destrano. ora, non riesco a capire (ne' a trovare referenze in lettaratura) se il metanolo mi ha "quenchato" la fluorescenza o se il destrano-FITC non è stato fissato con questo metodo! se fosse un problema di FITC mi basterebbe cambiare, tipo usare il TRITC o addirittura coinugare la mia proteina con un qualsiasi altro fluoroforo, mentre se il problema è che il metanolo non fissa la fluorescenza allora devo cambiare completamente metodo!!!qualcuno di voi ha notizie a riguardo?
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 13:40:07
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Non ho info precise da darti, ma so che nel mio vecchio lab l'idea di utilizzare
il metanolo per fissare dei vetrini da osservare a fluorescenza era decisamente
malvista. La paraformaldeide dà più garanzie in tal senso, probabilmente perchè
"quencha" di meno o affatto. |
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(F.W. Nietzsche)
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 14:57:05
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ok, a quanto pare il metanolo per l'immunofluorescenza non va. il problema è capire se dà problemi con tutti i fluorofori 
in effetti io ho già fatto prove con paraformaldeide, ma il problema è che l'anticorpo che uso non è un granchè e il metanolo ci sembrava il metodo migliore per avere un buon segnale, in più, dato che devo discriminare le mitosi dalle G2, per me è fondamentale avere un segnale "comprensibile"
comunque grazie  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 15:19:27
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Decisamente il destrano-FITC è fissabile in PF.
Altri fissativi che puoi provare sono:
95% etanolo / 5% acido acetico
50% etanolo / 50% metanolo
Acetone <--- attenzione a non farlo in piastre di plastica!!!! Le scioglie!!!
La PF la puoi provare anche a varie % (da 0.5 a 4% generalmente) |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 15:49:23
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io per fissare delle cellule usavo la paraforlmaldeide..
Cells were washed and fixated using 3% paraformaldehyde in DPBS for 60 min. Thereafter, the cells were washed three times, treated with 50 mM glycine in DPBS for 30 min to quench paraformaldehyde, and stained with 40 #956;g/ml filipin for a further 30 min |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 16:04:50
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si, la paraformaldeide l'ho sempre usata anche io, ma purtroppo c'è un problema di anticorpo, cioè, con la para (al 4%) il segnale è debolissimo   perciò stavo usando il metanolo |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 16:22:44
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| l'ai raffreddato prima a -20? |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 16:48:21
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| Noi fissiamo in acetone, perche' la PF poi da prob con gli anticorpi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 17:01:06
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Citazione:
Messaggio inserito da elly_
l'ai raffreddato prima a -20?
si, era freddo ma in generale come metodo per fissare le cellule è sempre andato bene. il problema riguarda la fluorescenza PRIMA del fissaggio. comunque una ricerca su google mi riporta ad una pagina (che non riesco ad aprire) che dice "...Methanol could dissolve the dyes. Formaldehyde should not affect fluorescence much..." |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 17:03:12
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Sì ricordo che la PF può dare problemi con gli Ab (li "fissa" a loro volta)
ma in teoria un robusto trattamento in NH4Cl dovrebbe neutralizzarne
la reattività. Ovviamente prima di incubare con gli Ab.
Nel mio lab facevamo 15 min a conc. 50 mM, e sentivo pure dire
che "il cloruro d'ammonio migliore la qualità dell'immagine". boh |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 17:08:05
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| Dipende da come è fatto l'anticorpo. Molti di quelli per immunoistochimica vengono prodotti contro il peptide fissato in PF. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 18:13:54
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In effetti dipende dall'anticorpo! Alcuni anticorpi funzionano bene con un fissativo e altri con un altro. Addirittura si possono ottenere risultati diversi con diversi fissativi.
Noi per le cellule usiamo sia Acetone che PFA, preferibilmente acetone, ma per alcuni anticorpi va meglio la PFA.
Il metanolo in effetti da "vaghi" ricordi mi sembra che possa dare problemi con la fluorescenza gia' presente, avevo fatto qualcosa del genere molto tempo fa.
Ti consiglio di fare una prova con l'acetone. Pasta mettere i vetrini con le cellule per 3-5 min in acetone freddo. Attenzione che come dice chick80 scioglie la plastica, se le tue cellule sono su "plastichini" per immunofluorescenza (quelli tipo lenti a contatto per intenderci) resistono anche in acetone, le petri invece no! (o meglio non tutte) |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 12:11:08
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allora, per chi è interessato c'è un aggiornamento. assodato che il metanolo dà problemi alla fluorescenza, volevo capire perchè, se fosse un problema di quenching o di mancata fissazione del fluoroforo. quindi ho fatto una prova al fluorimetro e ho preso del destrano-FITC e, già che c'ero, del destrano-TRITC, e li ho risospesi in metanolo, lasciato evaporare sotto cappa per 10 minuti e risospesi in PBS (per controllo ho usato il destrano-FITC/TRITC risospeso direttamente il PBS) e sono andata a leggere la fluorescenza. il risultato è che non c'è perdita di fluorescenza, il che indica che non è un problema di quenching ma verosimilmente un problema di mancata fissazione (quindi il destrano è stato lavato con blocco e lavaggi vari). detto ciò, il metanolo mi ha fatto perdere una settimana di esperimenti 
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 13:05:34
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Beh bella pensata!
Almeno questo è assodato! 
Comunque prova con altri fissativi e facci sapere! |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 13:56:51
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| yes, proverò un po' di metodi alternativi. |
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Discussione |
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FIX in metanolo
Didattica e Relazioni
