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Dees
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 Inserito il - 20 febbraio 2009 : 09:51:08
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Salve, so che la via più semplice è il sequenziamento, ma ora non riesco a farlo.
Durante delle amplificazioni per un determinato organismo (rickettsia), in alcuni campioni ho trovato degli amplificati ben visibili ad altezza diversa. C'è un modo per scoprire, nei vari DB, a cosa può corrispondere?
Speravo in un tool che, inseriti i due primers, desse le varie sequenze amplificate.
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dallolio_gm
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 09:54:37
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mah, prova quest tool:
- http://insilico.ehu.es/PCR/
Come vedi nella lista c'e' anche l'organismo che ti interessa.
Non conosco il tool, e ti consiglio di leggere l'articolo originale per sicurezza.
In ogni caso, devi trovare un tool per fare 'in silico pcr'. |
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Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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Dees
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 09:56:44
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Grazie. Il problema è che quella banda non corrisponde a rickettisa e nemmeno a una sequenza di DNA umano.
Per questo cercavo un tool per cercare in vari DB :)
Leggo l'articolo e proov a usare quello. |
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dallolio_gm
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 10:13:00
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Allora il problema e' piu' difficile.
Forse potresti provare con il tool per disegnare primer di ncbi:
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=NcbiHomeAd
Questo tool cerca di disegnare i primer eseguendo prima una ricerca con blast sul database di ncbi, in modo da calcolare la specificita' dei primers e vedere l'amplificazione di eventuali contaminazioni.
Un altro approccio che potresti usare e' quello segnalato nell'ncbi handbook: Fai un blast su nr con una sequenza disegnata in questo modo:
[sequenza primer forward][un numero di N piu' o meno uguale alla lunghezza della
banda amplificata, meno i primer][sequenza primer reverse opportunamente tradotta]
ovvero, una sequenza del genere:
CAGCATGATCGATCGATCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN\
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACGACGAGCGGTCGATCGATCAC |
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dallolio_gm
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 10:25:53
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Accidenti, non riesco a trovare il capitolo dell'NCBI handbook dove spiega il trucco delle NNN.
Secondo te, da cosa puo' derivare questa banda? Una contaminazione? Un errore nel design dei primer, o dei primer sbagliati?
Potrebbe anche essere che la sequenza del genoma dello strain con cui stai lavorando non sia piu' la stessa di quella su cui sono stati disegnati i primer, e che sia stata selezionata una qualche mutazione. |
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Dees
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 10:35:29
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E' piuttosto complicato: i campioni sono DNA estratto da sangue umano totale, in individui malati con (presunte) diagnosi varie e complicazioni. Ora, cercando rickettsia in questi individui, non la ho trovata ma in 2 di loro ho rilevato una altra banda. Lo so che, nel mio progetto, devo solo dire se hanno rickettisia o no, ma queste bande mi incuriosiscono :p
Escludo che si tratti di contaminazione della PCR visto che i controlli negativi sono puliti. Non è una contaminazione dei campioni né un problema relativo ai primers o ai setting della PCR visto che il controllo positivo con spike DNA (umano e rick)e il controllo di solo DNA rick sono riusciti perfettamente.
Ritengo di aver rilevato un altro organismo, probabilmente procariote, nel sangue di questi individui. Solo che non ho idea di cosa sia e al momento non posso sequenziare -.-
E' difficile perché hanno una storia clinica lunga e complessa quindi può essere qualsiasi cosa :)
Ripeto la PCR e, se riverifico le bande, mi ci butto a pesce ^^ |
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dallolio_gm
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 10:50:12
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interessante! :)
Io partirei proprio dal blast su ncbi con la sequenza di N per avere una idea. Considera, pero', che senza sequenziare e' difficile dire molto, e che anche avendo la sequenza, non tutti gli organismi sono disponibili su ncbi e quelli che vi sono, non sempre sono sequenziati con una buona coverage. |
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Dees
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Inserito il - 20 febbraio 2009 : 10:52:33
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Lo so che la sequenza è la cosa migliore, ma il capo non dà il via libera :p proverò tuttavia a infilare i campioni nel prossimo invio alla sequenziazione.
intanto volevo cercare di prevedere cosa potevo aspettarmi |
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problema PCR e identificazione sequenza
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