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mo-lab
Utente Junior
Cittā: utrecht
348 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2009 : 17:46:38
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ciao a tutti,
dopo aver fatto diverse prove di pcr mi ARRENDO..ho un esone di 119 bp contenuto in gc circa 60% che non viene in nessun modo..nemmeno con la pfx e l high fidelity..che fareste?
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Patrizio
Moderatore
Cittā: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2009 : 19:14:19
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da genomico?
hai uno smear? |
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
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mo-lab
Utente Junior
Cittā: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 14:37:31
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| genomico perfetto, primers pure, provo con il dmso... |
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Patrizio
Moderatore
Cittā: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 15:15:32
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a me non ha mai fatto miracoli il DMSO ...cmq facci sapere
per come la penso,il fatto che alcune PCR non escano potrebbe essere legato in alcuni casi ..o alla metilazione di regioni regolatrici,e qui non rientra il tuo caso,oppure a proteine che in quella regione si legano piu' saldamente ed e' difficile staccarle, inoltre... la sequenza rognosa
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AlessandroC
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2009 : 15:31:07
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guarda attentamente gli oligo...
č li che sta il problema...
prova ad abbassare la T° di annealing!!
La pfx oppure un'altra taq high fidelity non aumentano la resa ma evitano che vi siano errori...
cmq se gli oligo nn si legano l'amplificato nn lo vedrai mai...
Il DMSO invece serve solo ad aumentare la specificitā!!
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Patrizio
Moderatore
Cittā: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2009 : 22:03:43
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ricordo che per amplificare un gene ... le ho provate tutte !!!
non tutte ..di piu' !!
arrivai pure a digerire con enzimi il genomico caricarlo sul gel e spottare la parte interessata a quella T° di anniling che vedevo lo smear ... DMSO,ioni ..di tutto ..PCR in tutte le salse ..Hot start..touch down ....
ahahah .... no a va be mi fermo qui !
cmq ....nel suo caso gli converrebbe pensandoci ora, di amplificare da cDNA,e' molto piu' semplice |
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peppy
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2009 : 12:11:39
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| alla fine t é venuta? sn passati mesi...forse é un po' stupido che io scriva qualcosa ora...cmq hai provato cambiando il Taq? per pcr difficili d solito io uso l'accutaq (invitrogen)..e ha anche un buffer speciale! |
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mo-lab
Utente Junior
Cittā: utrecht
348 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2009 : 11:43:02
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si ho usato la gold t annel 66!
m e anche venuta la nested della stessa pcr!
ciau |
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esone malefico
Didattica
