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cicciput
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Inserito il - 23 febbraio 2009 : 17:13:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cicciput Invia a cicciput un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi!
vorrei sottoporvi 2 domande (che spero di riportare abbastanza fedelmente)dell'esame di ingegneria genetica:

come costruisco (con quali elementi) un costrutto (da iniettare direttamente nella blastocisti) per causare l'espressione di un gene in un topo transgenico? (non era specificato ma credo che il gene sia esogeno...)

In un southern blotting stringente una sonda ibrida solo con una sequenza strettamente omologa. Quante bande mi aspetto in autoradiografia? Se osservo più bande (tutte specifiche) come lo spiego?

grazie 1000!!!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 20:21:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh queste sono domande a cui dovresti rispondere dopo un po' di studio della materia... almeno una piccola idea ce l'hai?
Prova a dire a cosa hai pensato.

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cicciput
Nuovo Arrivato



21 Messaggi

Inserito il - 23 febbraio 2009 : 21:50:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cicciput Invia a cicciput un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
allora
1)un costrutto per creare knock-in deve potersi integrare in una sequenza di DNA, quindi:
-magari può avere 2 regioni di omologia flanking la sequenza che mi interessa inserire (quindi doppio cross-over?)
-ma DOVE andrà a inserirsi? Al posto di un introne? In tal caso, a partire dal 5', conterrà uno splicing acceptor site, un promotore forte, un gene reporter di fusione con il gene di interesse che voglio inserire, un poly-adenilation signal site, uno splicing acceptor site.
Qste sono le cose che ho scritto all'esame ma sono andata molto ad intuito in quanto durante il corso erano stati illustrati i topi knock-out
2)per quanto riguarda il Southern ero e rimango tutt'ora dopo il corso abbastanza ignorante...
Per quanto ne so' l'autoradiografia rivela la luminescenza della sonda radioattiva e quindi la banda è costituita dalla sequenza ibridata. Se nella reazione c'è 1 sola sonda altamente specifica dovrei rilevare 1 sola banda corrispondente al peso molecolare della sonda. Però se il mio templato (contenente frammenti di restrizione) è costituito, ad esempio, da porzioni di DNA altamente ripetitivo anche se di lunghezze diverse:
la sonda potrà appaiarsi, anche se localmente, a tutte queste sequenze e l'autoradiografia rivelerà i tanti frammenti diversamente lunghi (quindi tante bande). Non so' se questo ragionamento ha senso e comunque l'intestazione dell'esercizio non specificava nulla all'infuori del fatto che la sonda è altamente specifica e quindi ibrida SOLO CON SEQUENZE PERFETTAMENTE OMOLOGHE.

Ti sarei davvero grata se potessi chiarirmi le idee
grazie in anticipo
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cicciput
Nuovo Arrivato



21 Messaggi

Inserito il - 24 febbraio 2009 : 17:24:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cicciput Invia a cicciput un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mi è venuta in mente un'altra possibilità relativamente alla questione del Southern!!!
Il templato potrebbe essere costituito da RFLPs: frammenti in cui piccole differenze nella sequenza di DNA hanno alterato il profilo del pattern di restrizione (quindi l'enzima di restrizione genera frammenti di lunghezze diverse) ma non hanno disturbato la complementarietà con la sonda marcata. Con autoradiografia rilevo tante bande corrispondenti ai vari frammenti diversamente lunghi ma tutte ibridate con la stessa sonda specifica (che, ipotizzo, ibrida parzialmente, localmente). Che ne pensi? Please dammi 1 segno!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 25 febbraio 2009 : 00:10:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh bisogna vedere come ha valutato il tuo Professore/essa.
Comunque come dicevo nell'altra discussione il procedimento per fare topoi knock-in e knock-out è lo stesso.

Per quanto riguarda il Southern, anche io avrei pensato alla seconda cosa che hai detto, RFLP!
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