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cece23
Nuovo Arrivato



14 Messaggi

Inserito il - 25 febbraio 2009 : 19:02:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cece23 Invia a cece23 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao

Qualcuno mi può spiegare come si distingue se l'inserto di interesse è stato inserito nel verso sense o antisense?

Devo fare una pianta transgenica che sovraesprima un gene per cui le operazioni da fare sono:

1- amplificare il gene di interesse con primer che hanno in 5' le sequenze di riconoscimento degli enzimi di restrizione, per es. SacI per il forward e XmaI per il reverse.
2- subclonare questo frammento in un vettore pGEM-T e digerire poi con i due enzimi.
3- digerire il vettore d'espressione pBI121 con gli stessi enzimi e clonare il frammento.
4-elettroporare agrobacterium per inserire il plasmide d'espressione

Grazie

Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 14:12:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per sapere se il tuo inserto si è inserito nella maniera giusta nel vettore finale hai bisogno di sequenziare ma se hai creato le sticki end nel vettore e nell'inserto con due enzimi differenti hai la certezza che il tuo inserto si sia inserito correttamente ed in teoria non avresti bisogno del sequenziamento. Credo che il discorso che stai facendo tu riguardi il subclonaggio nel vettore transitorio.Se lo stai facendo per clonare direttamente il prodotto di PCR in maniera blunt è chiaro che quando digerisci l'inserto può essersi inserito nelle due orientazioni. In questo caso sapendo quanto pesa il tuo vettore, il tuo inserto, i potenziali siti di taglio degli enzimi ti sarà facile capire l'orientazione dl tuo inserto. Mi dispiace non poterti aiutare di più, se mi dai delle informazioni più precise ti aiuto perchè ho fatto una cosa molto simile a quella che stai facendo tu nel mio lab.
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cece23
Nuovo Arrivato



14 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 17:55:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cece23 Invia a cece23 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao

Grazie per la risposta. Effettivamente usando due enzimi diversi dovrei essere sicuro dell'orientamento dell'inserto. La procedura che devo usare però dipende molto dai vettori che sceglierò. Per il subclonaggio devo usare pGem-T perchè c'è lo già e non posso spendere molti soldi. Per il vettore binario invece non so quale usare. Per trasformazione di A. thaliana ho visto che si usa pBI121 o il pLARS120. Il problema è che non so quanto costino questi perchè non saprei da chi comprarli. Tu quale hai usato? L'unico vettore binario commerciale che ho trovato è il pRI909 della Takara. pBI121 so che veniva commercializzato dalla Clontech ma ora non è più in listino.

Grazie
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Connie
Nuovo Arrivato



1 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 18:17:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Connie Invia a Connie un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti,
mi sono appena iscritta e mi sono inserita qui(per favore scusatemi).
Ho la necessità/curiosità di presentarmi un mio problema.
Sono impegnata nel clonaggio del cDNA (nella forma W.t. e in tre diverse mutazioni) di un recettore di membrana fuso con la GFP.Le cose già fatte sono:
-amplificare la sequenza del cDNA presente in un altro plasmide (per fonferlo con la GFP)
-inserire l'amplificato nel plasmide di mio interesse
-fare analisi di restrizione per verificare la correttezza del costrutto
-mandare a sequenziare i plasmidi "corretti"
C'è da dire che con il costrutto W.t. ho avuto problemi!
-il responso del sequenziamento, per tutti i costrutti, ha evidenziato la scarsa affidabilità della LA polimerase usata (ma non importa, si va avanti)
-decido di intraprendere la via che mi permette (attraverso tagli con enzimi di restrizione)di eliminare da un plasmide la regione interessata dalle sostituzioni nucleotidiche e sostituirla con la stessa regione, senza mutazioni, di un altro plasmide
-sono riuscita ad ottenere quello che volevo per tre plasmidi ma per il plasmide con il cDNA W.t. sono tre mesi che mi dispero!
Tutta questa premessa mi è servita per dirvi che la metodica adottata poteva andare bene, avendo ottenuto tre costrutti.
Con il costrutto W.t. io penso ci siano problemi perchè non riesco ad avere colonie con il costrutto esatto: ho provato le cellule competenti TOP10 e le DH5alpha, oltre a provare un'infinità di rapporti di ligazione.Lo screenning delle colonie cresciute ha evidenziato la selezione di plasmidi che oserei definire assurdi! Ho fatto ligazioni di estremità blunt e di estremità steacky....................niente da fare!
Ok arrivo al dunque: è possibile che il costrutto w.t.abbia qualcosa che non vada? e se sì COSA?!? Vi ringrazio anticipatamente x la pazienza.
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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 27 febbraio 2009 : 16:19:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Rispondo a Cece23...Connie devi inserire una nuova discussione per parlare di un'altra cosa. Io non ne capisco molto di vettori per le piante..ho fatto una cosa concettualmente simile a quella che hai fatto tu nel senso che ho vettore transitorio per clonare direttamente il prodotto di PCR..ho usato 'zero pcr blunt'. PGEM non lo conosco ma credo che se usi un vettore transitorio lo fai per effettuare un clonaggio in maniera blunt e favorire la digestione del tuo inserto nel quale vuoi creare le estremità coesive sennò non credo abbia senso..quindi credo che abbia le blunt ends. Il vettore finale su cui invece volevo il mio inserto è pYESNT2C, un vettore binario per Saccaromiches. E l'ho creato digerendo il vettore transitorio e pYes con gli stessi enzimi. é nella fase di digestione del vettore transitorio deve fare attenzione al fatto che l'inserto può essersi inserito nelle due orientazioni per estrarre dal tuo gel la banda corretta da mettere in ligation con il vettore che sceglierai. Scusa, sono ritornata alla tua domanda percedente perchè è l'unica su cui so darti una risposta.
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