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Autore

Discussione

biotecman
Nuovo Arrivato

40 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 13:31:31

vorrei una piccola informazione sulla costruzione di una libreria di cDNA. Allora da quanto ho capito i passi sono questi:

1. estrazione mRNA
2. sintesi cDNA con oligodt e random primers
3. clonaggio dei frammenti ottenuti

Durante la retrotrascrizione vengono generati diversi frammenti di cDNA a singolo filamento ad opera dell'azione della retrotrascrittasi inversa a partire dall'oligodt o dai random primers, ma questi frammenti, dopo l'azione dell'RNAasi H rimangono a singolo filamento? come si effettua la sintesi del secondo filamento?

Nel mio tirocinio triennale studiavo delle isoforme specifiche quindi dopo la sintesi del cDNA effettuavo una PCR con dei primer specifici quindi non c'era questo problema; ma come si fa in questo caso? si legano degli adattatori ai cDNA formati dalla retrotrascrizione per l'amplificazione? Ma in questo caso come si possono generare librerie rappresentative se viene alterata tramite PCR l'abbondanza degli mRNA?

spero qualcuno possa darmi una risposta!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 27 febbraio 2009 : 00:07:02

Citazione:
Messaggio inserito da biotecman

Nel mio tirocinio triennale studiavo delle isoforme specifiche quindi dopo la sintesi del cDNA effettuavo una PCR con dei primer specifici quindi non c'era questo problema...

Questa � una cosa diversa!

Per rispondere alla tua domanda comunque si possono fare librerie di cDNA sia "amplificate" dopo PCR che librerie formate solo dall'mRNA presente non amplificato.
Per fare questo dopo la RT si degrada il filamento di RNA e per sintetizzare il secondo filamento si utilizzano ad es DNA polimerasi non termostabili, tipo la DNA polimerasi I che sintetizza solo il filamento complementare e si sfrutta il ripiegamento del cDNA a singolo filamento che fa da self priming.
Ci sono anche altri metodi, comunque ti consiglio di dare uno sguardo ai link che ho postato in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12068
sono certamente pi� esplicativi della mia breve spiegazione.

biotecman
Nuovo Arrivato

40 Messaggi

Inserito il - 27 febbraio 2009 : 10:52:36

grazie! :)