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blybos
Nuovo Arrivato


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12 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 17:09:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di blybos Invia a blybos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Ho un problemino da porvi e spero che qualcuno di voi mi possa aiutare.
Devo amplificare una sequenza inserita in un vettore ed aggiungere in coda ai primer dei siti ri restrizione specifici per il vettore in cui poi dovrò riclonarlo,perciò fissi e non modificabili.Inoltre la mia sequenza è piuttosto lunga(più di 2000bp)il che può complicare la riuscita della PCR.
Altro punto:nel disegnarmi i primer a mano purtroppo ho zero elasticità perchè devo far combaciare tutti i siti di restrizione e l'inizio e fine della sequenza,che devono essere contigui.Perciò mi capita di disegnare primer che però possono dimerizzare...chi mi sà dare qualche dritta su accorgimenti da prendere?
HELP! Credo che tra poco inizierò a parlare a triplette...

Ema

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 17:19:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh se non puoi evitare che formino dimeri, non puoi fare altro.
Comunque fai la tua PCR magari aumentando la quantità di primers e vedi se ottieni la banda. Poi puoi sempre purificare la banda da gel lasciando li i dimeri di primers per il clonaggio sucessivo.
Guarda io tempo fa ho utilizzato il sistema Gateway, e i primers avevano perforza delle lunghe sequenze (attB) che erano perfettamente complementari tra loro.
Migrando su gel avevo delle grosse "nuvole" di dimeri di primer, ma comunque ho estratto il mio amplificato da gel e ho continuato con gli step successivi.

2000bp non è una grandezza così elevata, è fattibilissimo, aumenta i tempi di estensione (in genere 1min/kb), oppure utilizza polimerasi per templati lunghi.

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blybos
Nuovo Arrivato


Prov.: Padova
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12 Messaggi

Inserito il - 26 febbraio 2009 : 18:38:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di blybos Invia a blybos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille davvero,terrò presente i tuoi consigli!
Buona serata!

Ema
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blybos
Nuovo Arrivato


Prov.: Padova
Città: Padova


12 Messaggi

Inserito il - 27 febbraio 2009 : 17:22:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di blybos Invia a blybos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho ancora un dubbio...se io devo creare una proteina di fusione con una porzione di proteina fluorescente e colloco quest'ultima a valle della prima, devo anche inserire la specifica sequenza di kozak della mia proteina fluorescente all'inizio della sua sequenza?

Ema
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 27 febbraio 2009 : 21:09:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No! Fai una "proteina di fusione" quindi "fondi" anche i codoni della tua proteina con quelli della proteina fluorescente. La proteina generata sarà una sola.
Ovviamente devi eliminare il codone di stop della tua proteina altrimenti ottieni solo la tua proteina e non una proteina di fusione.

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