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biomol
Nuovo Arrivato
65 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2009 : 12:37:57
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Ciao
avrei bisogno di informazioni su come strarre e coltivare linfociti. In particolare devo estrarre i linfociti dal sangue periferico (linfociti+monociti) di pazienti post-ischemici per andare a valutare alcuni parametri come espressione di molecole antiossidanti, danno perossidativo, ciclo cellulare, etc.
quindi avrei bisogno del protocollo completo per mettere in coltura i linfociti, cioè il tipo di terreno, che tipo di antibiotici e la quantità, se si deve aggiungere L-glutammina e PHA e le percentuali, ma soprattutto che tipo di nutrienti cioè se FBS o FCS e quanto.
Se è possibile avere un protocollo anche per congelarle e sapere se crescono in sospensione o in piastra.
Un altro problema che ho è capire che tipo di FCS si deve ordinare nel caso, perchè ho provato a vedere un pò sui cataloghi, ma ne ho trovati tantissimi e sinceremente non so quale si deve usare.
Grazie a chiunque sia in grado di aiutarmi
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2009 : 17:57:03
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per estrarre i linfociti da sangue periferico ti consiglio di utilizzre il Lympholyte H della Cedarlane, io mi sono sempre trovata benissimo, ottengo colture con 98% di purezza. Il terreno da utilizzare è l'RPMI 1640, per lo meno quello che adottiamo nel mio lab, non so se ce sono altri, della Sigma, addizionato di FBS al 10%, L-glutammina 2mM, penicillina-streptomicina a 100 U/ml, nistatina 10000 u/ml.
Non puoi congelare le cellule, riesci ad ottenere solamente colture primarie che non vanno oltre la settimana, poi sei costretto a rifare un nuovo isolamento. Crescono solo in sospensione, ed infatti per separare i linfociti dai monociti devi prevedere un'ora di recovery al termine dell'isolamento per consentire ai monociti di aderire e ai linfociti di rimanere in sospensione.
Invece della pha per eliminare le emazie io faccio un passaggio in una soluzione di NH4Cl pH 7.4 per 10 minuti, così liso gli eritrociti, mentre i linfociti non risentono di tale variazione di pH.
Per valutare la produzione di ROS puoi ricorrere all'NBT Test, la perossidazione la valuti col TBA Test. Per il resto non saprei.
Buon lavoro!!! |
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