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stef2
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2009 : 13:59:47
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Ciao ragazzi,
MI STO APPROCCIANDO ALLA MULTIPLEX PCR, POTRESTE INVIARMI SUGGERIMENTI UTILI, DALLA SCELTA DEI PRIMERS, ALLE DIVERSE CONDIZIONI PER NON INCORRERE IN PROBLEMI PER L'ESECUZIONE DELLA PCR?...ANCHE DRITTE ...!!!
GRAZIE ANTICIPATAMENTE
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stef2 |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2009 : 16:01:32
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Mah io di multiplex ne ho fatte molte e non ho mai avuto particolari problemi. Anche se a volte richiede un po' di tempo per la messa a punto.
La prima cosa è ovviamente quella di scegliere primers che diano amplificati di grandezza differente (almeno 100bp di differenza).
Ti consiglio di scegliere in ogni caso amplificati non troppo grandi, altrimenti i reagenti potrebbero essere insufficienti e dovresti cambiare più parametri nella messa a punto (ad es. aumentare i dNTPs).
Inoltre (se hai due o tre amplificati) è meglio se la differenza tra gli amplificati non è molta, altrimenti il prodotto a PM maggiore risulta svantaggiato, e ci sarebbe differenza nei tempi di allungamento.
Ad es io ho fatto un multiplex con un amplificato attorno alle 1000bp e l'altro attorno alle 200bp, ho dovuto modificare il protocollo utilizzando una concentrazione di primers maggiore per il prodotto a più alto PM (e ho anche aumentato la concentrazione di dNTPs).
Scegli i primers come per una normale PCR e poi quando li analizzi vai a vedere anche se formano dimeri tra di loro, cioè i primers della PCR1 con quelli della PCR2.
Ovviamente la temperatura di melting deve essere per tutti molto simile.
Poi passi alla "pratica" testi le varie PCR singolarmente, magari anche a varie T annealing per vedere in che range hai amplificazione e com'è il prodotto. Viste le condizioni migliori provi a fare la multiplex e vedi la resa. Se non è buona incominci a variare i parametri utilizzati.
Io non ho mai avuto particolari problemi (a parte con dei primers consigliati in un protocollo che alla fine ho buttato e ridisegnato!  ), ma magari è solo fortuna.
In ogni caso puoi anche leggere questo per avere ulteriori informazioni e consigli: Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol
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stef2
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2009 : 14:08:21
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| GRAZIE!!!!Farò sicuramente uso dei tuoi consigli!!! |
stef2 |
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farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2009 : 22:05:42
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| per la Taq usa l'Accuprime dell'Invitrogen |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2009 : 23:09:50
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Citazione:
Messaggio inserito da farmacologia
per la Taq usa l'Accuprime dell'Invitrogen
Si beh è sicuramente ingenierizzata per aumentare la specificità, ma non che con una Taq normalissima non possa venire! |
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Kika_Yeah
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 22 gennaio 2015 : 17:19:50
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Ciao!!!
Mi inserisco in questo topic sperando di trovare una risposta...
Mi avvicino alla multiplex PCR solo ora... Ed ho un maaaaaaaare di dubbi... Purtroppo chi dovrebbe/potrebbe aiutarmi non lo fa, così sono un po abbandonata a me stessa.
Devo necessariamente risparmiare non solo in termini monetari, ma anche in termini di DNA, quindi chiedo una mano per impostare una PCR multiplex. Devo utilizzare anche delle tail, ma non ho idea di quante ne ho a disposizione (spero 3 o 4) e mi chiedo come creare il mix di primer per amplificare i diversi LOCI contemporaneamente... Ho oltre 60 campioni da analizzare e un pool di 25 coppie di primer.
Tecnicamente dovrei creare uno stock di primer mescolati, ma col fatto che aggiungo la tail? Come mi devo comportare? E le concentrazioni dei primer stessi? Dovrei creare un tot di stock diversi, ovviamente, questo lo so... Ma vorrei saperne di più...
I primer li ho testati su 4 campioni della mia collezione e quelli scelti estrapolandoli da un pool più ampio ampificano tutti su quei 4 campioni. E, ovviamente, hanno temperatura di melting molto simile.
E la concentrazione di DNA ideale?
help, please!
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Multiplex PCR
Didattica
