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 Luciferase: conservazione lisato cellulare
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Aidil
Nuovo Arrivato

Città: Würzburg


2 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 16:45:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aidil Invia a Aidil un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve ragazzi, ho bisogno di voi!!
Devo effetuare una trasfezione transiente e usare il kit dual luciferase, abbiamo pero´un problema con il luminometro, serviranno un po´di gg per ripararlo.
Qualcuno di voi ha mai lisato le cellule con il lysis buffer e congelato il lisato in attesa di lettura?? Ho sempre usato effettuato l´analisi a momento!!! Se per favore mi dato qualche suggerimento. Inoltre lo conserverei a -80°C.
Grazie infinite

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 17:38:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mai fatto!!! Però credo tu lo possa conservare a -80°C senza alcun problema.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 19:30:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se è un lisato penso che puoi conservarlo tranquillamente...Nel laboratorio dove ho fatto il tirocinio preparavano un botto di lisati e li congelavano tutti, poi li usavano per le analisi che dovevano fare quando potevano...



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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 20:11:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sinceramente non l'ho mai fatto, non ho idea se l'intensità della luciferasi decada con il tempo durante il periodo di congelamento.
Io non mi fiderei tantissimo!!!
Prova a vedere in letteratura se trovi qualcuno che l'ha fatto su lisati congelati.
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 20:15:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Sinceramente non l'ho mai fatto, non ho idea se l'intensità della luciferasi decada con il tempo durante il periodo di congelamento.
Io non mi fiderei tantissimo!!!
Prova a vedere in letteratura se trovi qualcuno che l'ha fatto su lisati congelati.


Perchè dovrebbe decadere? Non è una proteina come altre?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 21:18:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Sinceramente non l'ho mai fatto, non ho idea se l'intensità attività della luciferasi decada con il tempo durante il periodo di congelamento.
Io non mi fiderei tantissimo!!!
Prova a vedere in letteratura se trovi qualcuno che l'ha fatto su lisati congelati.

Scusa ero di fretta, ho scritto intensità al posto di attività!


Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Perchè dovrebbe decadere? Non è una proteina come altre?

Beh è un enzima, non è detto che la sua attività non diminuisca con il congelamento.

Comunque facendo una rapida ricerca viene fatto anche su lisati congelati:
A new targeting approach for breast cancer gene therapy using the heparanase promoter.
Regulation of DeltaFosB transcriptional activity by Ser27 phosphorylation.
Mesothelin-mediated targeting of adenoviral vectors for ovarian cancer gene therapy.
Antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer inhibits viability of Escherichia coli in pure culture and in mouse peritonitis.

Solo l'ultimo è free, ma in sostanza gli altri dicono che i lisati sono stati congelati a -80°C poi scongelati e centrifugati a 10000g per 15min o 12000g per 5 min e poi è stata misurata l'attività della luciferasi.


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gilthanas
Nuovo Arrivato

0116_da_CIA



100 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 12:23:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gilthanas Invia a gilthanas un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dipende dal tipo di kit che stai usando...

E' il dual reporter assay o il dual-glo luc assay??

C'è molta differenza tra uno e l'altro...

Nel primo caso se hai estratto le proteine con buffer PLB (Passive Lysis Buffer o qualsiasi altro buffer di lisi compatibile non c'è problema...congeli le proteine estratte a -80 o se vuoi -20 (meglio -80) e fai il saggio successivamente sulle proteine scongelate.

Se si tratta del secondo il problema è che il buffer di lisi contiene già il substrato della lciferasi e non saprei se il segnale decade oppure no...mai fatto...
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jeje
Nuovo Arrivato



52 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2009 : 16:08:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao io l'ho usato.:
lisi poi congelo in azoto e lascio a -80.
ho provato arileggere cose che avevo nel -80 da piu di un mese e l'attività della luc un pochino era diminuita.
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Aidil
Nuovo Arrivato

Città: Würzburg


2 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2009 : 15:47:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aidil Invia a Aidil un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie a tutti!! Probabilmente compreremo un nuovo luminometro!!
In ogni caso il kit usato e´il dual report ( no substrato) e appena avro´occasione leggero´la luciferasi di questo esperimento!! anche per avere un´idea del tempo di conservazione!
Grazie ancora a tutti e a presto
Lidia
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