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farmacologia
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 Inserito il - 18 marzo 2009 : 07:10:32
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salve. ho provato a purificare il dna da tessuto di colon paraffinato. i protocolli utitizzati sono quelli della qiagen e dell'invitrogen. in ambedue i casi ho purificato dna, secondo me, estremamente degradato, tanto che non riesco ad amplificare pur avendo la certezza della presenza del gene di interesse (kras).
ritengo critica la prima fase e cioè quella dell'allontanamento della paraffina.
utilizzo, per sezioni di 10 micron 1 ml di xilolo per 20 secondi per poi effettuare due lavaggi con etanolo assoluto che allontano facendolo evaporare. credo di portarmi dietro della pareffina.
altro punto critico è la fissazione. non ho certezza che i campioni che mi arrivano dall'anatomia patologica vengano trattati con le adeguate concentrazioni di paraformaldeide (2% o 4%).
se tra di voi c'è qualcuno che ha esperienza in tal senso può aiutarmi? avete dei protocolli consolidati per la deparaffinizzazione?
grazie se vorrete aiutarmi
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GFPina
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Inserito il - 18 marzo 2009 : 07:23:37
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| Di solito per sparaffinare i vetrini si mettono in stufa a 56°C, scusa ma ora sono di fretta, ma cercherò un proocollo! |
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farmacologia
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Inserito il - 19 marzo 2009 : 06:46:26
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scusa gfpina. ma ci si ferma qui? lo xilolo e l'etanolo, i passaggi successivi, non si effettuano? mi puoi far capire?
grazie veramente.
tato |
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 19 marzo 2009 : 10:49:00
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Scusa farmacologia, ieri mattina ero di fretta, poi mi sono completamente dimenticata! 
Protocolli qua non ne ho, probabilmente ho qualcosa in Italia.
Comunque visto che la paraffina in genere dai vetrini si elimina col calore, il mio ragionamento era semplicemente che un trattamento col calore ti aiuta ad eliminarla.
Comunque sia 20sec di incubazione con lo xilolo mi sembrano pochi, prova a passare a 1-3min.
Un'altra cosa che puoi fare è fare il passaggio in xilolo a caldo, incubando a 50°C.
(P.S. piccola considerazione: ma usate ancora xilolo? Usare sostanze meno tossiche tipo bioclear o altre?)
Per il problema di fissazione non credo tu ci possa fare molto, potresti chiedere come fanno in anatomia patologia a fissarli, ma fargli cambiare protocollo la vedo difficile!
Ah dimenticavo, in ogni caso cerca di eliminare la paraffina in eccesso (all'esterno della fetta di tessuto) prima di procedere. |
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farmacologia
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Inserito il - 19 marzo 2009 : 17:54:55
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ciao gfpina. in effetti uso HISTOLEMON, elimino la paraffina in eccesso.
forse sciogliendo la para a 56 °c e incubando a 50 gradi l'HISTOLEMON aumentando il periodo, forse metto a punto |
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 19 marzo 2009 : 19:42:03
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Citazione:
Messaggio inserito da farmacologia
forse sciogliendo la para a 56 °c e incubando a 50 gradi l'HISTOLEMON aumentando il periodo, forse metto a punto
Si io dicevo che i vetrini li metti a 56°C, per l'estrazione puoi anche semplicemente incubare a 50°C e fare un tempo più lungo. |
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farmacologia
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Inserito il - 19 marzo 2009 : 20:56:42
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poichè le mie sezioni sono di 10 micron, queste non sono depositabilil su vetrino, per cui le metterò ad incubare a bagno maria a 56 °c in una eppendorf per sciogliere la paraffina per poi trattarle con histolemon.
in settimana prossima inizio il protocollo  e sicuramente ti farò sapere.
speriamo bene.
grazie ancora |
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GFPina
Moderatore
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Inserito il - 19 marzo 2009 : 21:28:58
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No intendevo solo che quando fai l'istologia per sparaffinare i vetrini li metti in stufa a 56°C per 1h poi passi ai vari passaggi di xylene (o simili) e scala degli alcoli.
Il calore aiuta ad eliminare la paraffina.
Per l'estrazione se metti ad incubare in xylene (o simili) a 50°C dovrebbe essere sufficiente, senza metterli prima a 56°C. |
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