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masi
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43 Messaggi

Inserito il - 19 marzo 2009 : 12:37:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masi Invia a masi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, mi scuso in anticipo per la domanta stupida!
Spero il tutto sia così banale da ottenere risposta, vorrei iniziare a fare silenziamento genico in colture cellulari, ma non so proprio da dove partire(nel mio lab non è mai stato fatto),ma vorrei capire praticamente cosa devo fare! Di teoria ne ho trovata e ho capito il principio su cui si basa, ma in sostanza io ho delle cellule in coltura cosa gli devo fare? cosa devo acquistare? cosa si trova pronto e cosa devo fare io?...non sono riuscita a capire la pratica!
Grazie!

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 19 marzo 2009 : 14:28:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il workflow è generalmente questo:

1) Parte in silico: cerchi la sequenza del trascritto
in un database e provi a vedere se sono già stati
disegnati dei siRNA o dei costrutti di silencing,
o se il tuo target è bersaglio di un miRNA. Se nulla
di tutto cià è disponibile, è il caso di ricorrere a
tools per il design de novo (i più gettonati sono questo e questo)

2) Parte molecolare: individuate le sequenze si/miRNA, devi ora
costruirle. Potresti volerli sintetizzare direttamente tramite
trascrizione in vitro, oppure potresti volerli subclonare in un
costrutto plasmidico o virale a partire da cassette sintetiche,
ampliconi PCR, cloni ecc. dipende da qual'è il tuo modus operandi.
Ogni sistema ha i suoi vantaggi e i suoi svantaggi.
Soprattutto ci sono differenze nei costi.

3) Parte in vitro: per testare in vitro i tuoi costrutti puoi transfettarli
direttamente come oligo siRNA/miRNA, oppure puoi servirti di un
vettore d'espressione. Ovviamente devi scegliere cellule che
esprimano il gene target, ovvero quello che vuoi silenziare,
in modo QUANTIFICABILE. La cosa migliore in genere è quella
di testare il silencing su proteine eterologhe taggate.

4) Eventuale passaggio all'in vivo

Se nel tuo lab non è mai stato fatto ti consiglio
fortemente di cercare supporto da parte di qualcuno
che ci ha già lavorato (io non l'ho fatto e ho voluto
buttarmici di testa mia, e ho preso grossissimi abbagli)


Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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masi
Nuovo Arrivato




43 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2009 : 11:47:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masi Invia a masi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io ho provato a cercare di capire i tuoi consigli, ma come ho scritto mi manca proprio il concetto di base, ti spiego meglio avrei avuto bisogno che tu mi spiegassi come si spiega ad un bambino che on ne sa nulla. Non so in quali database cercare, non so come fare a sapere se il mio target è un miRNA!
Ho bisogno di spiegazioni sulla base base. Il protocollo cosa si mette dove, non ho MAI lavorao con RNA!
Grazie
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