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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 12:46:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se devo clonare una proteina in un plasmide di espressione con un tag di His al N- Terminale e al C-terminale devo fare in modo che ci sia un'unico Orf dall'ATG del plasmide al codone di stop del plasmide stesso? Cioè non devo considerare il codone di inizio e di fine della mia proteina ma quelli del plasmide. Se lascio il codone di stop della mia proteina all'interno del plasmide la fase di lettura viene interrotta e l'His tag al N-terminale non viene sintetizzato. é un giusto ragionamento? Se non mi sono spiegata bene fatemi qualke domanda e proverò a spiegarmi meglio. Grazie.

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 18:43:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io non l ho mai fatto ...ma a senso ..direi che il cDNA deve ovviamente essere in frame con il tag dell His,quindi ...dovresti amplificare con un revers che non abbia lo stop
..ma attendi conferma di chi ci ha gia' lavorato


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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 18:54:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Flap

Se devo clonare una proteina in un plasmide di espressione con un tag di His al N- Terminale e al C-terminale devo fare in modo che ci sia un'unico Orf dall'ATG del plasmide al codone di stop del plasmide stesso? Cioè non devo considerare il codone di inizio e di fine della mia proteina ma quelli del plasmide. Se lascio il codone di stop della mia proteina all'interno del plasmide la fase di lettura viene interrotta e l'His tag al N-terminale non viene sintetizzato. é un giusto ragionamento? Se non mi sono spiegata bene fatemi qualke domanda e proverò a spiegarmi meglio. Grazie.


Si il ragionamento è giusto! Quindi devi clonare il cdna senza l'ATG e senza lo STOP, stando attento/a a non andare fuori frame...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 19:45:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusami ma non ho capito un po' di cose:

Citazione:
con un tag di His al N- Terminale e al C-terminale

Non ho capito: a quale dei due?!? A entrambi?

Di solito si fa al C-terminale, che corrisponde
all'estremità 3' della tua ORF: in tal caso va
inserito DOPO il codone di stop, avendo cura di
abolirlo e di far sì che le istidine dell'His-tag
siano in frame con la fase di lettura principale
(quella "giusta") del tuo inserto di cDNA.

Citazione:
Cioè non devo considerare il codone di inizio e di
fine della mia proteina ma quelli del plasmide

Non ho capito: nel tuo plasmide ci sono già dei codoni di start e stop?
Io penso che ce ne sarà solo uno di stop dopo il'His-tag coding sequence.

Citazione:

Se lascio il codone di stop della mia proteina all'interno del plasmide la fase di lettura viene interrotta e l'His tag al N-terminale non viene sintetizzato. é un giusto ragionamento?


Sì, è così.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 20:36:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo con Dionysos,
a parte l'ultima precisazione:

Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

Citazione:

Se lascio il codone di stop della mia proteina all'interno del plasmide la fase di lettura viene interrotta e l'His tag al N-terminale non viene sintetizzato. é un giusto ragionamento?


Sì, è così.

No non è così! L'N-terminale sta davanti (all'inizio della tua proteina) il codone di stop sta alla fine, quindi se fai una proteina di fusione con His Tag N-terminale lo stop della tua proteina lo devi lasciare!
Se fosse C-terminale è il contrario!
Tanto per intenderci:


HIS TAG N-Terminale                       HIS TAG C-Terminale

Dall'immagine si capisce molto bene, comunque:
HIS TAG N-Terminale: devi togliere l'ATG, ma tenere lo stop
HIS TAG C-Terminale: devi tenere l'ATG ma togliere lo stop

A meno che il tuo vettore non contenga già anche ATG e stop (di solito no)

Il fatto di avere His-Tag sia in C che in N terminale mi sembra strano.
Comunque al posto di stare qua a disquisire sulle possibilità, magari dicci qual'è il vettore che devi utilizzare e facciamo prima!

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 14:17:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, mi sono sbagliato. Il "sì, è così" teneva conto dell'His-tag C-terminale,
non N-terminale, ho letto in fretta e non ci ho badato. Sorry.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 14:28:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il plasmide è PyesNt2C..mi sa ke l'His tag sta al N-Terminale anche sil plasmide che uso ti da la possibilità di farli entrambi. Però nel mio caso, come qualcuno ha detto, forse devo usare l'ATG del plasmide e togliere quello dal cDNA della mia proteina mentre utilizzo il codone di stop del mio cDNA e lo tolgo dal plasmide. Però vi mando la mappa.

Allegato: pyes2ntc_mcs.pdf
19,1 KB
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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 14:53:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma non c'è bisogno che tolgo il codone di stop dal plasmide tanto se lascio quello della proteina l' mRNA si ferma lì e non va oltre. L'importante è che tolga l'ATG della mia proteina senza andare fuori frame. Giusto?
Scusate , un altra cosa...il primer al 5'ha i siti per gli enzimi di restrizione che io ho scelto e al 3'dovrebbe appaiare bene con il mio gene. Ma per quanti nt deve appaiarsi bene per essere un buon primer?Quale percentuale della sequenza può non 'combaciare ' a causa dell'esigenza del clonaggio? Mi sembra tutto tanto complicato
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 16:56:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

Sì, mi sono sbagliato. Il "sì, è così" teneva conto dell'His-tag C-terminale,
non N-terminale, ho letto in fretta e non ci ho badato. Sorry.

Certo era chiaro che era una svista, perché non avevi letto bene!
Ma dovevo fartelo notare studentello modello!!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 17:01:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora in quel plasmide in effetti il tag di istidine c’è sia al C che all’N-terminale, ma se leggi il protocollo ti dice di farlo N-terminale:
Citazione:
To ensure proper expression of your recombinant protein, you must clone your gene in frame with the ATG at base pairs 511-513. This will create a fusion with the N-terminal polyhistidine (6xHis) tag, Xpress epitope, and the enterokinase cleavage site.

Se vuoi puoi farlo anche C-terminale:
Citazione:
The pYES2/NT and pYC2/NT vectors also contain a C-terminal peptide encoding the V5 epitope and a polyhistidine (6xHis) tag. If you wish to express your recombinant protein WITHOUT the C-terminal peptide, be sure that your insert includes a stop codon.
If you wish to express a recombinant protein that contains both the N-terminal peptide and the C-terminal peptide, make sure that you design your cloning strategy such that your insert is cloned in frame with both the N-terminal and C-terminal peptides.

Se lo vuoi solo N terminale deve essere in frame con l’ATG del vettore e contenere il codone di stop della tua proteina, altrimenti la traduzione va avanti, se vuoi anche il C-terminale devi stare attenta che sia in frame anche quello.

Comunque poniamo il caso che lo vuoi solo N-terminale.

Prendendo la sequenza dalla posizione 582 per fare l’esempio (è tutta divisa in triplette in frame rispetto all’ATG in posizione 511-513), e poniamo che tagli con KpnI (non so che enzima utilizzi ma nel caso fai un discorso analogo con gli altri)
La sequenza è questa:
582 CTG TAC GAC GAT GAC GAT AAG GTA CC^C  GGA TCC AGT GTG GTG GAA TTC

Ho segnato in rosso la sequenza riconosciuta da KpnI e con ^ dove avviene il taglio, quindi tagliando il vettore otterrai:
582 CTG TAC GAC GAT GAC GAT AAG GTA CC^         C GGA TCC AGT GTG GTG GAA TTC

Il tuo frammento da inserire quindi dovrà contenere la sequenza per l’enzima KpnI e la sequenza codificante senza l’ATG, cioè a partire dal secondo codone.
Poniamo che la sequenza sia:
ATG CCG ACG CAT ....... TGA

dovrai ottenere questo frammento:

GGTAC^C CCG ACG CAT ....... TGA GGTAC^C


Che verrà tagliato così:
C CCG ACG CAT ....... TGA GGTAC

E inserito nel vettore così:
582 CTG TAC GAC GAT GAC GAT AAG GTA CCC CCG ACG CAT ....... TGA GGTACC GGA TCC AGT GTG GTG GAA TTC

Nota che ho considerato che il frame sia rispettato solo al 5’ (C-terminale), al 3’ non ti interessa altrimenti dovresti considerare anche quello (anche se in questo caso se controlli comunque è in frame)
Altra cosa, per semplificare ho considerato un singolo taglio nel vettore con solo un enzima di restrizione. Se ne usi 2 fai le dovute considerazioni, comunque quello importante è il primo per avere la proteina in frame con il tag di His C-terminale.


Ora per disegnare i primers devi tener presente che non si mette subito la sequenza per l’enzima di restrizione, ma si mettono delle basi prima altrimenti l’enzima fa fatica a tagliare sequenza poste al terminale, il numero preciso di basi che metti non è importante tanto vengono tagliate via, tipicamente ne metti 3-6.
Quindi il tuo primer forward potrà essere ad es:
TAATGGTACC CCG ACG CAT......


Considerazione banale ma importante: prima di tagliare con qualunque enzima, controlla che l’enzima non tagli anche all’interno del tuo frammento!!!

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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 17:29:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quindi il tuo primer forward potrà essere ad es:

TAATGGTACC CCG ACG CAT......


Ma..il primer non dovrebbe avere le basi complementari a quelle della sequenza? Se le basi sono le stesse come avviene l'appaiamento?
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GFPina
Moderatore

GFPina

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8380 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 18:16:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa la domanda Flap, ma a parte per il clonaggio, hai mai disegnato un primer?
Forse dovresti sapere alcune nozioni di base prima di passare a cose complicate!

Citazione:
Messaggio inserito da Flap

Quindi il tuo primer forward potrà essere ad es:

TAATGGTACC CCG ACG CAT......


Ma..il primer non dovrebbe avere le basi complementari a quelle della sequenza? Se le basi sono le stesse come avviene l'appaiamento?

È complementare infatti alla sequenza a cui si appaia!

Il DNA fatto così:
5' CCG ACG CAT CCA TGG ACT TAA CGA CCT AGG 3'
3' GGC TGC GTA GGT ACC TGA ATT GCT GGA TCC 5'
il primer forward si appaia alla sequenza 3'-5' (quella non codificante) e quindi è uguale alla sequenza 5'-3'.
il primer reverse al contrario si appaia alla sequenza 5'-3', quindi è complementare a questa e invertito.

5' CCG ACG CAT CCA TGG ACT TAA CGA CCT AGG 3'
                            3' GCT GGA TCC 5' (primer reverse) 
5' CCG ACG CAT 3' (primer forward) 
3' GGC TGC GTA GGT  ACC TGA ATT GCT GGA TCC 5'

che vengono scritti sempre come tutte le sequenze in direzione 5'-3' quindi:
primer forward: 5' CCG ACG CAT 3'
primer reverse: 5' CCT AGG TCG 3'
ovviamente le sequenza e i primers sono più lunghi in realtà, li ho disegnati così solo per fare un esempio veloce!!!
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Dionysos
Moderatore

D

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Inserito il - 23 marzo 2009 : 19:16:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Certo era chiaro che era una svista, perché non avevi letto bene!
Ma dovevo fartelo notare studentello modello


-.- sgrunt

Citazione:
Nota che ho considerato che il frame sia rispettato solo al 5’(C-terminale)


Volevi dire N-terminale? (ghgh)

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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 23 marzo 2009 : 22:15:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

Citazione:
Nota che ho considerato che il frame sia rispettato solo al 5’(C-terminale)


Volevi dire N-terminale? (ghgh)

Ma hai scandagliato il messaggio in cerca di un errore???
Comunque ti è sfuggito, l'ho scritto ben 2 volte!
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Nota che ho considerato che il frame sia rispettato solo al 5’ (C-terminale), al 3’ non ti interessa altrimenti dovresti considerare anche quello (anche se in questo caso se controlli comunque è in frame)
Altra cosa, per semplificare ho considerato un singolo taglio nel vettore con solo un enzima di restrizione. Se ne usi 2 fai le dovute considerazioni, comunque quello importante è il primo per avere la proteina in frame con il tag di His C-terminale.
ok comunque era N-Terminale!
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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 13:31:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No..in realtà non ne ho mai disegnati..hai ragione tu, mi mancano un pò di nozioni di base. Proverò a colmare le lacune.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 21:12:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Flap

No..in realtà non ne ho mai disegnati..hai ragione tu, mi mancano un pò di nozioni di base. Proverò a colmare le lacune.

Si non prenderla male ma prima di passare alla pratica e rischiare di fare casini (visto che già altri li hanno fatti nel tuo caso), forse è meglio sapere un po' di teoria.
Capisco che non essere seguiti o essere seguiti male sia brutto (ci sono passata anch'io) però alcune cosa basta studiarle, poi si può sempre chiedere aiuto e consigli.
Comunque se guardi sul forum un po' di discussioni al riguardo ci sono.

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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2009 : 16:54:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No..me ne guarderei bene dal passare alla pratica. Però siccome un giorno dovrò farlo sto cercando di capire come si fa. Ma sto ancora alla teoria..pura e semplice teoria ovvero studio. Non me la prendo a male..figurati. sicuro che ho gia studiato dove si appaiano i primers ma l'ho dimenticato perchè non mi era mai capitato di utilizzare quest'informazione. Anzi grazie per la chiarezza con cui hai risposto alla mia domanda..mi hai fatto tornare in mente quello che era sepolto in qualke angolino della mia memoria.
PS. Il dna a doppio filamento pero lo sapevo..era che il fR si appaia al filamento non codificante e il RV a quello non codificante che mi sfuggiva completamente
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