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aero
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Inserito il - 23 marzo 2009 : 19:06:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di aero Invia a aero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Vi espongo il mio problema sperando che qualcuno possa aiutarmi a capire come risolverlo...
Io faccio estrazione di DNA da brodocolture batteriche utilizzando un metodo che prevede adsorbimento alla silice in presenza di guanidina isotiocianato, lavaggi successivi con etanolo 80% e con acetone ed infine eluizione in acqua milli q.
La scorsa settimana ci è arrivato il biofotometro, così ho iniziato a leggere le concentrazioni degli estratti e a valutarne la purezza. Il problema è che per alcuni di essi ho un rapporto 260/280 intorno a 1,1- 1,3 quindi se non sbaglio dovrebbe esserci una contaminazione da proteine, mentre per la maggior parte il rapporto è >1,8 quindi dovrei avere ottenuto degli estratti puri, almeno per quanto riguarda le proteine.
Come posso fare a eliminare il problema della contaminazione da proteine per le estrazioni future?

Cmq ciò che più mi preoccupa è il rapporto 260/230 che non è per niente intorno a 2,2 ma per tutti i campioni è bassissimo: da 0,01 a 0,2 circa. Questo, se non sbaglio, dovrebbe essere indice di una contaminazione da sali..potrebbe essere dovuto alla non completa eliminazione della guanidina isotiocianato contenuta nei buffer di estrazione?? (in effetti nella metodica che utilizzo c'è scritto di rimuovere, dopo spinnatina, tali buffer per inversione..sarebbe forse meglio eliminare anche i residui con puntali con filtro e micropipetta?)
Inoltre, siccome ho letto che l'etanolo è molto importante per rimuovere questi inquinanti, e possibile che io abbia vortexato troppo poco le eppendorf e che questo sia stato sufficiente a risospendere la silice ma non a consentire all'etanolo di rimuovere i sali?? Vortexando di più e quindi lasciando agire l'etanolo più a lungo, potrei migliorare il rapporto 260/230? Se no, qualcuno ha qualche idea sul perchè ottengo un rapporto così basso e su come potrei fare a non avere questo problema per le estrazioni future?

E per i campioni già estratti (che conservo a -20°C per periodi piuttosto lunghi) potrei avere dei problemi utilizzandoli in una PCR classica e al massimo in una multiplex con i rapporti di purezza che ho ottenuto? In caso c'è un modo per purificare i miei estratti (ac. nucleici eluiti in acqua) prima di procedere all'amplificazione e quindi all'eletrroforesi??

Scusate il mare di parole e di domande, spero di essermi fatta capire e che qualcuno chiarisca i miei dubbi dandomi qualche chiarimento e qualche buon consiglio.
Grazie.

aero
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9 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2009 : 19:26:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di aero Invia a aero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi sono dimenticata una domanda!
Questi rapporti di purezza non molto buoni, possono rendere non attendibili le letture delle concentrazioni del DNA (ng/ul) date dallo spettrofotometro?

Tante grazie
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aero
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9 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2009 : 17:53:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di aero Invia a aero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nessuno ha qualche suggerimento???
Devo assolutamente capirne di più e trovare qualche soluzione... vi prego aiutatemi!!!!
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angemore
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Inserito il - 25 marzo 2009 : 22:11:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non ho mai usato questo protocollo per estrarre il DNA comunque posso suggerirti una cosa...se vuoi recuperare il materiale che hai ottenuto fin'ora perchè non provi a precipitare il DNA , a rilavarlo per bene con l'etanolo e a rileggere i rapporti?
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aero
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9 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 13:54:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di aero Invia a aero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
come faccio a precipitare il DNA, visto che ormai non cel'ho più miscelato con la silice, ma nella fase finale della mia estrazione l'ho eluito con acqua milli q, quindi, per es., se centrifugo ed elimino il surnatante, oltre al DNA, non precipito anche le impurezze?
Come posso fare quindi?
Grazie mille.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 26 marzo 2009 : 14:48:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Aggiungi tampone acetato 1:10 + 2:1 di EtOH freddo (lascialo almeno un'ora nel -20°C).
Centrifuga alla max velocità per 10-15 minuti possibilmente a 4°C.
Getta il surnatante e lava il pellet con EtOH 70%.
Lascia evaporare l'etanolo all'aria e risospendi in un opportuno volume di acqua o TE.

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aero
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9 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 19:59:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di aero Invia a aero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie chick80!!
Non essendo molto pratica, avrei però un paio di cose da chiederti..
Innanzitutto qual'è la ricetta per preparare il tampone acetato? Immagino di dover utilizzare sodio acetato e acido acetico ma in che proporzioni e a quale pH?
Poi non ho ben capito in quali rapporti devo aggiungere il tampone acetato e l'etanolo raffreddato a -20°C al mio estratto.. ad es. se ho 100 ul di DNA in acqua milli q, quanto tampone dovrei aggiungere e quanto EtOH? (Abbi pazienza ma non ho capito i rapporti 1:10 e 2:1 come sono riferiti al mio DNA e agli altri reagenti! )
Poi visto che ci sono,il lavaggio del pellet con quanti ul di EtOH 70% consigli di farlo? Poi se ho capito bene risospendo al vortex per lavare il mio pellet (sarà sufficiente un paio di minuti?) e lascio evaporare l'etanolo all'aria o posso mettere le eppendorf in un riscaldatore a secco ad es a 56°C per fare prima?
Infine, volendo non solo pulire il DNA, ma magari anche concentrarlo un pò, potrei risospenderlo ad es. in 50ul di acqua anzichè nei 100 di partenza.. che ne dici?

GRAZIE MILLE per i tuoi consigli e per le spiegazioni che spero mi darai..proverò sicuramente a vedere che succede, poi magari ti faccio sapere
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 20:45:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai ragione, ero un po' di fretta e non mi sono spiegato bene

Citazione:
Innanzitutto qual'è la ricetta per preparare il tampone acetato?

Fai semplicemente una soluzione 3M di Na-acetato e portala a pH 5.2
Questo permetterà di neutralizzare le cariche dei fosfati del DNA grazie alla formazione di un sale sodico del DNA.
L'EtOH ha una costante dielettrica < di quella dell'acqua e quindi favorisce la formazione di questo sale che quindi precipiterà (a volte lo vedi precipitare anche a occhio nudo). Dimenticavo che conviene lasciarlo una ventina di minuti in ghiaccio prima di centrifugare per permettere la precipitazione. So di gente che lo lascia o/n a -20°C, io sinceramente non l'ho mai fatto, ma potrebbe dipendere dalla quantità di DNA immagino.

Citazione:
Poi non ho ben capito in quali rapporti devo aggiungere il tampone acetato e l'etanolo raffreddato a -20°C al mio estratto.. ad es. se ho 100 ul di DNA in acqua milli q, quanto tampone dovrei aggiungere e quanto EtOH? (Abbi pazienza ma non ho capito i rapporti 1:10 e 2:1 come sono riferiti al mio DNA e agli altri reagenti! )


I rapporti sono riferiti al DNA. Conta comunque che è una precipitazione, non è una cosa ultraprecisa...
Quindi se hai 100ul di DNA metterai 10 ul di NaAc e poi aggiungi 200 ul di EtOH.

Citazione:
Poi visto che ci sono,il lavaggio del pellet con quanti ul di EtOH 70% consigli di farlo?

L'ho sempre fatto un po' a caso... 200-300 ul, qualcosa così.

Citazione:
Poi se ho capito bene risospendo al vortex per lavare il mio pellet (sarà sufficiente un paio di minuti?) e lascio evaporare l'etanolo all'aria o posso mettere le eppendorf in un riscaldatore a secco ad es a 56°C per fare prima?

No, no! Non devi ridissolvere il pellet nell'etanolo. Lavi delicatamente il pellet con 200-300 ul di etanolo, poi rovesci la provetta in modo da buttare la gran parte dell'etanolo. A questo punto lasci le provette aperte all'aria (io di solito le metto a testa in giù su un pezzo di carta assorbente per fare evaporare l'etanolo. Puoi anche metterli nel riscaldatore a secco se vuoi, anche se probabilmente 37 gradi sono più che sufficienti.
Una volta che il pellet è secco aggiungi l'acqua e passi sul vortex.

Citazione:
Infine, volendo non solo pulire il DNA, ma magari anche concentrarlo un pò, potrei risospenderlo ad es. in 50ul di acqua anzichè nei 100 di partenza.. che ne dici?

Sì, anzi conviene fare così, al massimo poi ridiluirlo è un attimo!

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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 21:04:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io di solito uso 1/10 di volume di naAc 3M pH5.2 e 2,5 volumi di EtOH 100% freddo (ma credo proprio che sia la stessa cosa che ti ha detto chick80) mi raccomando è importante agitare bene prima di mettere le provette a -80°C . Ti suggerisco di aggiungere anche il glicogeno secondo la quantità che ti indica la sheet (di solito ne uso 1 microlitro ma non ricordo la concentrazione del mio stock) perchè ti aiuterà a vedere il pellet di DNA dopo la centrifugazione per 30' a 4°C alla velocità max.
Se vuoi concentrare di più il DNA puoi anche risospendere con 50ul di acqua invece di 100ul stando attenta che il DNA si risospenda bene e che l'acqua non sia troppo poca.
Prima della lettura a volte metto la provetta per 10' a 37°C per far risopendere meglio il DNA. Ciao fammi sapere
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 21:20:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho sentito che altre persone aggiungono glicogeno, ma sinceramente non ho mai capito perchè? Sai per caso che ruolo ha?

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 26 marzo 2009 : 22:01:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Ho sentito che altre persone aggiungono glicogeno, ma sinceramente non ho mai capito perchè? Sai per caso che ruolo ha?

E' un carrier, serve per aumentare la resa della precipitazione sopratutto quando le quantità di DNA sono poche. (stesso ruolo svolto dalla acrilamide lineare che si usa sopratutto per l'RNA)
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 22:17:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E' una molecola inerte che migliora l'efficienza della precipitazione (ora il principio esatto con cui ciò avviene non lo ricordo ma se vuoi quando torno in lab. posso controllare). Se lo aggiungi durante la precipitazione ti rende il pellet di DNA ben visibile anche se è poco concentrato (il pellet diventa biancastro). Io lo trovo utile anche perchè lavoro con poco materiale di partenza e quindi a volte è difficile riuscire a vedere il pellet.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 22:19:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Aggiungo solo qualche commento a quello già detto! Concordo con chick80 che l'unica è provare a riprecipitarlo (anche se a volte non si riesce ad eliminare tutto il contaminante).

Quando rifai l'estrazione la prossima volta prova a lavare meglio con Etanolo, non so esattamente cosa dica il tuo protocollo comunque vortexa molto bene e magari lascialo agire di più, vedi se così migliora.

Assicurati anche che l'etanolo sia evaporato bene prima di eluire con acqua.

Citazione:
So di gente che lo lascia o/n a -20°C, io sinceramente non l'ho mai fatto, ma potrebbe dipendere dalla quantità di DNA immagino.

Si è per quello, anche quello aiuta a riprecipitare quando hai quantità scarse di DNA (o anche con l'RNA)

Ci sono vari metodi di precipitazione con vari sali, comunque sodio acetato va benissimo e il volume di etanolo è da 2 a 3 volumi rispetto al tuo DNA.
Al posto di etanolo puoi usare isopropanolo, ne va messo meno basta 1 volume rispetto al DNA iniziale, precipita meglio il ma trattiene di più i sali ed è meno volatile dell'etanolo, per questo motivo il secondo lavaggio si fa comunque con Etanolo al 70%.
L'etanolo al 70% deve essere sufficiente a lavare bene il tuo pellet, 1 o 2 volumi rispetto al DNA di partenza bastano.

Ah non mi sembrava fosse scritto, dopo aver lavato bene con etanolo al 70% (vortexxa bene!) ovviamente devi ricentrifugare per ripellettere.
Infine assicurati che l'etanolo sia evaporato, anch'io inverto la provetta, ma non fare seccare troppo il pellet di DNA altrimenti diventa più difficile da risospendere. (metterlo a 56°C molti lo fanno ma a me personalmente non piace molto).

Puoi tranquillamente riprecipitare anche i campioni conservati a -20°C.

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aero
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2009 : 01:01:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di aero Invia a aero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie a tutti!! Domani ci rifletto a mente lucida e se mi viene in mente qualche dubbio vi faccio sapere
Ancora grazie mille, siete fantastici
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legolas
Utente

0121_da_legolas

Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi


723 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2009 : 08:37:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di legolas Invia a legolas un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
comunque per soluzioni di DNA non pure puoi utilizzare il metodo colorimentrico per il dosaggio degli acidi nucleici.
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