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metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge


45 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 20:41:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metionina Invia a metionina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!

sono in crisi con una PCR che non vuole venire! è una PCR a partire da un frammento di 3000pb estratto da gel d'agarosio. in pratica, ottengo ogni volta uno smear molto evidente su tutto il gel. ho provato di tutto:
- cambiare temperatura di annealing
- cambiare concentrazione di MgCl2
- cambiare concentrazione dei primers
- cambiare concentrazione del DNA di partenza
- cambiare Taq
- cambiare lit di estrazione dal gel
ma nulla! non riesco ad riamplificare il frammento e ottemgo sempre e solo un grande smear!!!!
i primer sono giusti e non è un problema di contaminazioni e DNAsi.

qualcuno ha idee?? help!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 20:57:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Capire cosa succede in questi casi non è facile!
Comunque...

Tu estrai da gel un frammento da 3000bp giusto?
Ma qesto frammento da cosa è ottenuto? Un'altra PCR?
Poi da questo cosa amplifichi? Tutto o una parte?
Come fai l'estrazione da gel? Metti il gel sul transilluminatore e ritagli la banda?
Hai provato per curiosità a riseminare parte del DNA estratto da gel per vedere se è integro?

Ok più che una risposta ti ho fatto mille domande, ma è per cercare di capire cosa possa essere il problema!
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metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge


45 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 21:11:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metionina Invia a metionina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
- il frammento nasce da una LFH-PCR ovvero metto insieme 3 frammenti che in parte si sovrappongono e amplifico. quindi quel frammento che vedo sul gel è l'unica cosa da cui posso partire per clonare.

- cerco di riamplificare tutto il frammento

- si, metto il gel supra gli UV, taglio e estraggo con kit (ho provato il kit Qiagen, Promega e Millipore)

- dopo aver estratto da gel ho rideposto e ho ben il frammento alla taglia attesa

se hai un'idea è veramente ben accetta!!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 21:21:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il fatto del transilluminatore te lo dicevo perchè al DNA non fa molto bene essere esposto agli UV, io per estrarre da gel visualizzavo solo un frammento del gel tagliavo dove c'era la banda e poi fuori dagli UV tagliavo la banda dal resto del gel (ok detto così non si capisce, ma mi ricordo di averlo postato un bel po' di tempo fa)
Scusa sono un po' stanca e non ho molte idee, comunque altra cosa hai provato ad amplificare per caso frammenti più piccoli dal tuo frammento? Si riesce?
Altra cosa l'extension è abbastanza lunga per un frammento di quelle dimensioni? Hai provato a variare anche quella?
Infine hai cambiato TAQ, ma sono Taq che vanno bene per amplificazione di frammenti lunghi?
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metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge


45 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2009 : 21:44:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metionina Invia a metionina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
frammenti più piccoli si, e riesce la PCR.
le Taq le ho provate tutte... magari provo con aumentare l'extension, anche se la faccio già a 3 minuti per ciclo e 10 minuti finali!
possano esistere dei problemi nelle estremità? ah che nervi! a volte vorrei possedere una lente di ingrandimento in grado di vedere a livello molecolare la sequence per capire!!
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2009 : 00:18:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusami,a parte che io non avrei messo tre frammenti insieme ma ne avrei fatti 2 alla volta.
se la banda che spotti sei sicura che sia quella attesa,vedi se puoi verificare con enzimi di restrizione (anche uno solo,che tagli quanto piu' al centro possibile )
se ti viene la digestione ed hai dei primers diversi ...usali :)
,alza parecchio la T°di anniling dei vecchi e testa a diverse T° i nuovi
La banda eluita che poi vai a ricaricare sul gel ...falla correre parecchio,come diceva silvia capire in questi casi cosa succede e' difficile figuriamoci se lo si cerca di capire per iscritto
facci sapere


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