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bellastoria
Nuovo Arrivato

Prov.: Bayern
Città: wuerzburg

21 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2009 : 10:00:41

Salve,
Sto mettendo a punto un nuovo western blot per la mia ricerca. Utilizzo degli estratti cellulari per ricercare delle proteine di interesse con anticorpi.
Quando vado a ricercare una delle due proteine.... Jun fosforilato.... il risultato dello sviluppo è una grande membrana nera o grigiastra e le bande delle proteine sono bianche... che significa? qualcuno ha mai avuto la stessa esperienza? Utilizzo il protocollo standard
blocking con latte in polvere 5%
membrana di nitrocellulosa
lavaggi 3x 15 min tbst

Sapete aiutarmi???
grazie
F.

mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato

116 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2009 : 11:02:12

carichi troppo il primario. diluiscilo almeno il doppio o il triplo. mi è capitato una cosa simile una volta.
ciao e fammi sapere se risolvi in questo modo

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2009 : 16:05:47

Si concordo con mattia.dinunzio, prova a diluire l'anticorpo!
Puoi anche provare a diluire l'anticorpo nel blocking.
Il nero della membrana è dato dal fatto che c'è del fondo (che può essere dovuto appunto al troppo anticorpo) e la bande bianche sono dovute al fatto che la reazione è troppo forte e si "brucia" la membrana (forse riesci a vedere anche delle bande marroncine sulla membrana corrispondenti alla bande bianche sulla lastra)

bellastoria
Nuovo Arrivato

Prov.: Bayern
Città: wuerzburg

21 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2009 : 17:01:57

Intanto grazie per il vostro aiuto tempestivo, spero di risolvere il problema con la diminuzione dell'Ab primario... vi faccio sapere i risvolti...
grazie
F.

Ricciola
Nuovo Arrivato

38 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2009 : 14:18:16

ciao,
a me succede non di rado con l'actina quando mi viene over-espressa, quindi concordo con gli altri devi abbassare la concentrazione degli anticorpi, in particolare del 1°