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 lettura e quantificazione RNA totale
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ChEyEnNe
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Inserito il - 07 aprile 2009 : 17:43:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ChEyEnNe Invia a ChEyEnNe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho un piccolo problema.....

eseguo un'estrazione di RNA totale da cellule eucariotiche.
Per stabilire la purezza e la quantità di RNA procedo in questo:

mi serve avere un volume pari ad 1 cm di lunghezza per la lettura in assorbanza (il datasheet della mia mw dice che 10.67 mm = 360 µl)
dunque voglio sapere quanti µl corrispondono ad 1 cm ed ecco.....

1.067 cm : 360 µl = 1 cm : x µl
x = (360µl x 1 cm) : 1.067cm = 337µl volume finale nel pozzetto

ora faccio una diluizione 1:337


1) leggo in assorbanza a 260nm e 280nm

260nm = 0.0932
280nm = 0.0725

2) da questo rapporto 260/280 dovrei ottenere un valore tra 1.7<x<2.1 per considerarlo puro

(0.0932 : 0.0725) = 1.28 (NON PURO)

3) ora dovrei quantificare

OD 260nm x 40µg/ml x 337 = 1256.336µg/ml

io possiedo 100µl di RNA TOT e dunque imposto questa proporzione:
1256.336µg/ml : 1000µl = x : 100
dunque x = 125.6µg RNA TOT nei miei 100µl

questi dovrebbero essere i miei valori!
è corretto il procedimento e di conseguenza la formula?
non avendo la possibilità di usare delle cuvette sono costretto a seguire questa via e volevo avere delle certezze sulla procedura.

Sapendo dalla letteratura che 1 cellula possiede ~0.01ng RNA TOT, possedendo io 3400000 cellule totali mi aspetterei ~34µg di RNA TOT; ottenendo un valore quasi 4 volte più grande non so fino a che punto considerare attendibile il primo dato (125.6µg) oppure il secondo (~34µg).

Qualche delucidazione?

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 07 aprile 2009 : 23:03:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma scusa perchè 1cm? Che metodo utilizzi? Leggi in una micropiastra e hai il fascio di luce perpendicolare alla micropiastra che attraversa il campione? Se ho capito giusto.

Comunque i conti mi sembrano corretti, ma quella concentrazione è un po' elevata. Hai provato a fare delle diluizioni inferiori ad esempio a leggere 5microlitri anziché uno?
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ChEyEnNe
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16 Messaggi

Inserito il - 08 aprile 2009 : 09:18:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ChEyEnNe Invia a ChEyEnNe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
leggo direttamente in multiwell e non in micropiastra....

uso 1cm, per il fatto che per poter usare la legge di Lambert-Beer, il raggio d'assorbanza deve percorrere la lunghezza di 1cm

comunque proverò a quantificare dei campioni di RNA noto e poi farò sapere.
ti ringrazio per ora
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 08 aprile 2009 : 10:34:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non ho capito come fai ad escludere del tutto che nel tuo estratto ci sia anche del DNA genomico che altera la tua lettura.
Dato che il DNA genomico assorbe con un profilo simile all'RNA, il tuo campione potrebbe contenere anche pochissimo RNA e tanto DNA genomico.
Se non lo corri su gel o non usi la DNasi non puoi sapere con certezza se quello che leggi è effettivamente tutto RNA.

La determinazione della purezza che fai serve per escludere le tracce di fenolo, lipidi e proteine, ma non distingue RNA da DNA

poi l'attendibilità dell'RNA totale presa dalla letteratura dovrebbe essere presa con le giuste cautele poiché, dipende dalla linea cellulare, dallo stato in cui si trovano le cellule, dal trattamento, dal mezzo che usi, dalla quantità e tipo di siero etc etc. Quindi è possibile una variazione anche notevole da quello che ti aspetteresti.

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 08 aprile 2009 : 12:14:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa potresti farci capire meglio il procedimento?
Tu lisi le tue cellule, estrai l'RNA e poi metti in una multiwell 1ul di RNA estratto + 376ul di acqua (o TE) e fai la lettura?

Il procedimento di fare un campione lungo "1cm" per la legge di L-B, mi sembra possa andare come ragionamento. Solo che anche se come dice Neuroscience la quantità di RNA può essere molto diversa da quella riportata in letteratura (per vari motivi), quella che ottieni mi sembra veramente elevata. Hai fatto un trattamento con DNasi?
Puoi anche provare a leggere il campione con e senza trattamento con DNasi per vedere se il problema è quello.
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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato



16 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2009 : 13:46:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ChEyEnNe Invia a ChEyEnNe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
allora il procedimento è questo:
lisi, estrazione RNA(con kit per estrazione e di conseguenza l'uso di DNAse), poi diluisco tot µl in 340µl di H2O rnase free e poi lettura a 260nm/280nm.

quello che leggo dovrebbe essere un "buon" RNA totale.
ho fatto delle prove con RNA a valore noto (5mg/ml) ed ottengo 4.8mg/ml....penso di poterlo considerare attendile.

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

.....quella che ottieni mi sembra veramente elevata...



se fosse sbagliato il mio calcolo dovrebbe esserlo anche la quantificazione del RNA noto!?!?
ho fatto diverse letture di prova a diverse diluizioni (1:340 - 1:200 - 1:100 - 1:68 - 1:34) ed ottengo una buona approssimazione con ratio 1:200 - 1:100...
penso dunque di aver risolto...
un grazie a tutti
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2009 : 17:04:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da ChEyEnNe

se fosse sbagliato il mio calcolo dovrebbe esserlo anche la quantificazione del RNA noto!?!?


Non è detto se hai una contaminazione da DNA la lettura è elevata perchè leggi anche il DNA.
Io un trattamento con DNasi per togliermi il dubbio, e anche per evitare che ci sia DNA per gli utilizzi che devi fare del tuo RNA, lo farei!
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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato



16 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2009 : 10:33:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ChEyEnNe Invia a ChEyEnNe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io usa il DNAsi per l'estrazione di RNA....
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