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carlo.m
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 27 aprile 2009 : 19:46:35
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Ciao a tutti, avete un protocollo per elettroporare le CHO?
E' da un pò di tempo che ci provo, con diversi voltaggi, diverse quantità di DNA, diversi buffer di elettroprazione (PBS, Hepes, Optimem...).
Il problema è che ho proprio risultati scarsi: le cellule stanno molto male e si elettroporano poco. Invece le CHO sono conosciute proprio per la loro facilità di elettroporazione.
Come elettroporatore utilizzo il Bio-Rad Gene Pulser II.
Grazie per gli aiuti e ciao!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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carlo.m
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 27 aprile 2009 : 23:17:22
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Mai fatto, ma qui trovi molti protocolli per elettroporazione, magari qualcuno potrebbe esserti utile
http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/search.cgi?query=electroporation
Grazie, effettivamente però ho già consultato molti protocolli online, tra cui naturalmente quelli della Bio-Rad stessa. E il brutto è proprio questo, che non mi sono stati di molto aiuto, perchè hanno un'infinità di variabili che via via ho testato, ma con scarsi risultati. |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2009 : 18:01:07
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| io uso il sistema di elettroporazione AMAXA (ora Lonza credo) e va benissimo |
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carlo.m
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2009 : 16:47:20
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Citazione:
Messaggio inserito da AleXo
io uso il sistema di elettroporazione AMAXA (ora Lonza credo) e va benissimo
Anche se usiamo strumenti diversi, il che non è poco anzi è importantissimo, posso farti alcune domande per indirizzare meglio la mia ricerca per un protocollo efficiente di elettroporazione dell CHO?
Ecco alcune domande:
1) che buffer di elettroporazione usi? Io ho provato PBS, HEPES ed Optimem, il migliore come sopravvivenza è risultato l'Optimem
2) quanto DNA/numero cellule utilizzi? Io sto elettroporando 5000000 CHO in 400 microlitri di buffer; ho notato che già con 10-20 microgrammi di DNA le cellule soffrono terribilmente e l'efficienza stessa di elettroporazione è bassissima.
3) le CHO possono esere coltivate sia in aderenza che in sospensione: tu elettropori le CHO in aderenza o in sospensione?
4) che voltaggio ed eventualmente capacitanza usi?
Se hai qualche ulteriore dritta te ne sarei grato! |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2009 : 23:26:04
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scusa la risposta...devi per forza elettroporarle per trasfettarle??
con tutti i nuovi reagenti di trasfezione direi che ti risolveresti la vita...si forse così risparmi un pò, però se hai problemi io cambierei il metodo di trasfezione.... |
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Elettroporazione CHO
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