Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 PCR su PCR
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu


121 Messaggi

Inserito il - 04 maggio 2009 : 16:27:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Avrei una domanda...qualcuno di voi ha mai fatto una PCR su un prodotto già amplificato?
e se sì, come si fa? quanta PCR iniziale va utilizzata?
Spero tanto che qualcuno possa aiutarmi!!!

Aureus
Utente Junior

0613_da_Fil23

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola


123 Messaggi

Inserito il - 04 maggio 2009 : 17:18:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aureus  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Aureus Invia a Aureus un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,

forse tua intenzione è di fare una PCR Nested...
...molto semplice, dalla tua I° PCR disegni dei primer interni "Inner", poi amplifichi con le tue condizioni ideali che avrai appurato con un semplice softwere tipo "Oligo"...
...molto spesso la PCR Nested consente di aumentare notevolmente la sensibilità e la specificità della PCR soprattutto nei casi in cui la presenza del targhet iniziale è molto bassa..



www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi
Torna all'inizio della Pagina

Aureus
Utente Junior

0613_da_Fil23

Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola


123 Messaggi

Inserito il - 04 maggio 2009 : 17:27:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Aureus  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Aureus Invia a Aureus un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Come si fa...
...ovviamente le condizioni saranno quelle della prima PCR, tenendo conto che c'è più amplificato targhet...

Quanta PCR iniziale va utilizzata...
Io di solito utilizzo tutto il prodotto di PCR per fare la PCR secondaria..

...io di solito lo faccio per vedere il genoma di EBV HHV7 e HHV8 che in cellule infette non si trovano in enormi quantita..
...tu? Su cosa la fai?

Immagine:

71,08 KB

www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 04 maggio 2009 : 18:09:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si a me è capitato di farle, non solo nested ma riamplificare con gli stessi primers il prodotto di PCR per svariati motivi, c'era anche una discussione in proposito.

Comunque dipende molto da quanto è il prodotto di PCR che ottieni, io per le nested ho sempre usato 1-5ul di prodotto di PCR diluito da 1:1000 a 1:10000.

EDIT: ecco la discussione in cui se ne parlava
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=9386

Torna all'inizio della Pagina

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 05 maggio 2009 : 12:33:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie ad entrambi...siete stati molto gentili.
Dunque...non avevo bisogno di fare una nested, ma i tuoi consigli, aureus, sono cmq ben accetti!!!
Intendevo fare una PCR e poi, sul prodotto riamplificare con gli stessi primer, come diceva GFPina.
Ad ogni modo...
...l'ho fatto ieri pomeriggio utilizzando 5uL della prima PCR ed oggi quando ho controllato sul gel, la mia banda c'era ed era ben forte, ma c'erano anche altre bande. In particolare una molto vicina a quella d'interesse.
Come posso spiegarmi questa cosa? (non si tratta di una contaminazione!ne sono certa)
Grazie
Torna all'inizio della Pagina

mak_steon
Utente Junior



138 Messaggi

Inserito il - 05 maggio 2009 : 16:36:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mak_steon Invia a mak_steon un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
I primer che utilizzi sono molto specifici? Magari col fatto che c'era una grande quantità di DNA si sono legati aspecificatamente.
Le bande secondarie sono molto intense?

Potrebbe essere opera di nucleasi inquinanti? (Possibilità molto remota lo so)

Una curiosità: dopo la prima PCR non vedevi proprio niente oppure una debole banda c'era?

Ciao ciao
Torna all'inizio della Pagina

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 07 maggio 2009 : 17:39:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora...
...gli oligo che utilizzo sono specifici: mi servono per tirarmi giù l'inserto che dovrò clonare (posseggono, quindi, anche i siti per gli enzimi che ho scelto).
Le bande secondarie sono molto deboli tranne una, molto vicina come peso al mio amplicone.
Le nucleasi le escluderei!
La prima PCR che ho fatto aveva solo la mia banda d'interesse e per giunta molto molto forte; nessuna banda aspecifica, nemmeno debolissima.
Chissà che roba sono quelle bande?!
Ciao e grazie
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 07 maggio 2009 : 19:54:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Possono essere degli aspecifici! Se la tua PCR era già buona prima e avevi una bella banda 5ul della prima PCR (in non so quanto) sono veramente tanti, è normale che ti saltino fuori anche cose aspecifiche. Potresti aver avuto qualcosa di aspecifico anche nella prima PCR che non vedevi ma riamplificando ti salta fuori.

Prova a fare la seconda PCR partendo da meno templato.
E poi al massimo estrarrai la tua banda da gel.

Ma una cosa mi sfugge, ma se la banda era già bella nella prima PCR perchè fai anche la seconda?
Forse che la prima era con primers senza siti di restrizione e la seconda con gli stessi primers ma con i siti di restrizione?
Torna all'inizio della Pagina

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 12 maggio 2009 : 16:51:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie del consiglio...se dovesse ricapitare lo seguirò!
La cosa è un po' complicata...dovevo inserire una sequenza in un vettore prendendola da un altro vettore.
Purtroppo questo secondo vettore mi è finito e non abbiamo soldi per ricomprarlo.
La prima PCR che ho fatto è andata bene, ma poi nei vari passaggi fino alla restrizione, il mio frammento è scomparso (il kit con cui eluisco da gel ha rese piuttosto basse!).
Alla fine mi sono detta:" ok...ho ancora 5 uL di PCR...cosa posso farci?" e così...
Ecco tutto. Avevo anche pensato di fare una PCR inversa inserendo la sequenza che mi serviva direttamente sul vettore, ma inserzioni così grandi non le ho mai provate...dovrei mettere a punto un protocollo. Ho optato per la cosa che mi sembrava più fattibile nell'immediato.
Grazie ancora!!!
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 12 maggio 2009 : 18:26:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ecco svelato il mistero!
Spero che il clonaggio alla fine sia venuto bene!


Torna all'inizio della Pagina

miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2009 : 01:32:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La cosa è un po' complicata...dovevo inserire una sequenza in un vettore prendendola da un altro vettore.
Purtroppo questo secondo vettore mi è finito e non abbiamo soldi per ricomprarlo.


ciao

anche io spero che il tuo clonaggio sia ok

ma domanda,,, forse stupida...
ma perche' prima di finire il vettore non l'hai riamplificato?
anche se e' un vettore commericiale
si puo' amplificare tranquillamente

Torna all'inizio della Pagina

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2009 : 12:03:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Spero anch'io che sia venuto bene...nel senso che sto screenando dei cloni positivi alla colony-PCR, sui quali faro altri controlli domani. E poi...solo il sequenziatore mi dirà se è venuto o meno!!!

"ma perche' prima di finire il vettore non l'hai riamplificato?
anche se e' un vettore commericiale"

Perchè era un vettore linearizzato presente in un kit in cui mancava praticamente tutto ...alla fine ho optato per la PCR con tanto di risciacquo di provetta contenente il vettore!!!
grazie ancora a tutti!
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina