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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
 Inserito il - 04 maggio 2009 : 22:07:28
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Allora ho ricevuto un plasmide pNIC che include il gene che specifica CSAD ( Cysteine sulfinic acid decarboxylase ), il mio scopo è quello di trasferirloi nel vettore pET43 .
In laboratorio avevano già congelati 3 campioni chiamati 1/10 , n2 , n3 di cDNA CSAD .
Abbiamo preso 200 ng / microlitro della eppendorf contenete n2 e abbiamo fatto una diluizione 1:20 o 2,5 : 20 , non ricordo , mi è stato detto che ora avevamo 10 ng / microlitoro con qst diluizione ed è stato fatto qst calcolo 47,5 microlitri di H2o e 2,5 microlitri di DNA n2 .... da dove arrivano i risultati di qst diluizione ?
Abbiamo preso 100 microlitri di E.Coli ( rosetta ) e lo abbiamo aggiunto ad una soluzione 0,5 microlitri di DNA n2 ( diluirta come soppra ) e abbiamo aspettato 30' per la trasformazione.
MI AIUTATE A CAPIRE QST PARTE DELL'ESPERIMENTO , vE NE SAREI DAVVERO MOLTO GRATO
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Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2009 : 23:19:43
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Allora la diluizione era 1:20
infatti parti da una soluzione 200 ng/ul e arrivi ad una concentrazione 10ng/ul, quindi 1:20 --> 200/20 = 10
Citazione:
è stato fatto qst calcolo 47,5 microlitri di H2o e 2,5 microlitri di DNA n2
La diluizione 1:20 è stata fatta in 50ul finali
50/20 = 2,5
quindi 2,5ul di DNA + 47,5ul di H2O
Dopo di che il DNA diluito è stato messo con le cellule di E. Coli ed è stata fatta avvenire la trasformazione
Citazione:
Abbiamo preso 100 microlitri di E.Coli ( rosetta ) e lo abbiamo aggiunto ad una soluzione 0,5 microlitri di DNA n2 ( diluirta come soppra ) e abbiamo aspettato 30' per la trasformazione.
questo penso sia chiaro, o c'è altro che ancora ti sfugge?
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2009 : 13:59:42
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A ho capito cioe lui a preso 200 microlitri di plasmide contenente il gene , con una pipetta ( quelle in plastica , della eppendorf che premi con il pollice , nn mi ricordo il nome ) poi l'ha messa in una provetta piu piccola da 50 microlitri , tipo una eppendorf ? , e poi l'ha diluita 1:20 , di modo da avere 2,5 ng / microlitri di Plasmide e 47,5 microlitri di acqua distillata . e poi l'ha trasformato cosi :
incubare le cellule competenti con DNA in ghiaccio per 30 minuti;
- trasferire a 42°C per 1 minuto (shock termico);
- raffreddare in ghiaccio per 2 minuti;
- aggiungere 1 ml di terreno LB ed incubare i campioni a 37°C sotto agitazione
per un’ora in modo da consentire al gene che conferisce la resistenza
all’antibiotico di esprimersi.
Infine, la sospensione di cellule viene piastrata su terreno solido (LB agar)
contenente l’antibiotico, la cui resistenza è portata dal DNA trasformante. Le
piastre vengono incubate a 37°C per almeno 16 ore.
Ci sono ?? |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2009 : 18:50:50
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Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
A ho capito cioe lui a preso 200 microlitri di plasmide contenente il gene
NO! La soluzione in cui c'era il plasmide contenete il gene era 200ng/ul (questa è la concentrazione!)
Ha preso 2,5 microlitri di questa soluzione e li ha messi in una provetta assieme a 47,5ul di H2O, il volume totale finale è 50ul.
La diluizione che è stata fatta è 1:20, perchè sono 2,5ul in 50ul finali, quindi: 2,5ul/50ul = 0,05 (che è 1:20).
La concentrazione finale è 10 ng/ul perchè parti da 200 ng/ul e lo diluisci 20 volte: 200 ng/ul /20 = 10 ng/ul.
Questa parte è solo una diluizione del DNA plasmidico iniziale.
Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
con una pipetta ( quelle in plastica , della eppendorf che premi con il pollice , nn mi ricordo il nome )
si chiamano "micropipette" o semplicemente pipette.
Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
poi l'ha messa in una provetta piu piccola da 50 microlitri , tipo una eppendorf ?
si l'avrà messa in una provetta più piccola, che non sarà da 50 microlitri perchè penso che non esistano!
Sarà stata una provetta di tipo eppendorf da 1,5ml o 500ul (le più comuni). 50 microlitri come ho detto prima è il volume finale in cui hai la diluizione.
Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
e poi l'ha diluita 1:20 , di modo da avere 2,5 ng / microlitri di Plasmide e 47,5 microlitri di acqua distillata
Questo te l'ho spiegato prima, la concentrazione è 10ng/ul.
Citazione:
Messaggio inserito da terreno85
e poi l'ha trasformato cosi :
incubare le cellule competenti con DNA in ghiaccio per 30 minuti;
- trasferire a 42°C per 1 minuto (shock termico);
- raffreddare in ghiaccio per 2 minuti;
- aggiungere 1 ml di terreno LB ed incubare i campioni a 37°C sotto agitazione
per un’ora in modo da consentire al gene che conferisce la resistenza
all’antibiotico di esprimersi.
Infine, la sospensione di cellule viene piastrata su terreno solido (LB agar)
contenente l’antibiotico, la cui resistenza è portata dal DNA trasformante. Le
piastre vengono incubate a 37°C per almeno 16 ore.
ok |
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