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dossena
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 06 maggio 2009 : 12:03:25
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Ciao a tutti avrei bisogno di sapere se ci sono delle proteine housekeeping che abbiano un peso molecolare superiore ai 60 KDa, in quanto nel mio gel al 6 % perdo gli housekeeping classici come: tubulina, actina e GAPDH.
Grazie mille
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 06 maggio 2009 : 18:41:52
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Scusa se la mia domanda può sembrarti sciocca, ma che proteina stai analizzando? Magari facendo una ricerca su pub med si possono trovare dei lavori in cui hanno fatto dei western e vedere che housekeeping hanno usato... |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2009 : 14:53:35
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| aumentare la % di gel, no? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2009 : 19:30:40
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Citazione:
Messaggio inserito da mattia.dinunzio
aumentare la % di gel, no?
Beh fosse così semplice... dipende da che proteine devi vedere!
Citazione:
Messaggio inserito da dossena
Ciao a tutti avrei bisogno di sapere se ci sono delle proteine housekeeping che abbiano un peso molecolare superiore ai 60 KDa, in quanto nel mio gel al 6 % perdo gli housekeeping classici come: tubulina, actina e GAPDH.
Grazie mille
Ho lo stesso problema per alcuni gel, io uso alfa-actinina che è attorno a 100kDa, non sono soddisfattissima al 100%, mi fido comunque poco delle proteine citoscheletriche ma rispetto ai cambiamenti notevoli che ho con beta-tubulina è decisamente meglio.
Inoltre se guardi sul sito della Abcam sono consigliati una serie di loading controls: http://www.abcam.com/index.html?c=4147
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dossena
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 22 maggio 2009 : 15:56:25
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Grazie GFPina tu si che mi risolvi la vita 100 KDa è perfetto!!!!
Per rispondere non posso aumentare la % del gel altrimenti non vedo la mia proteina che è grossa 280KDa!!!!!!! |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2009 : 16:49:20
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Scusa GFPina... ma perchè non 6 soddisfatta delle prot citoscheletriche?
Che vuol dire che hai grandi variaz con la beta-Tubulina?
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Ascoltami con gli occhi... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2009 : 18:51:00
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| Molti trattamenti influenzano le proteine del citoscheletro, mentre tu vuoi un housekeeping che sia abbastanza costante... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2009 : 21:21:09
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Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Scusa GFPina... ma perchè non 6 soddisfatta delle prot citoscheletriche?
In parte ti ha già risposto chick80, comunque il citoscheletro è abbastanza sensibile ai cambiamenti che avvengono all'interno della cellula, ad es. quando un cellula che dei problemi è il primo ad andarci di mezzo!
Le proteine citoscheletriche secondo me non sono proprio tra le migliori come housekeeping. Poi se si tratta di western blot sicuramente la differenza è meno evidente, ma ad es. con real-time PCR che (oltre a valutare ovviamente RNA e non proteine) è molto più sensibile le differenze sono maggiori. Esistono lavori in cui dimostrano che le proteine del citoscheletro non sono di fatto "housekeeping"
Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Che vuol dire che hai grandi variaz con la beta-Tubulina?
Vuol dire che io ho analizzato cellule sottoposte ad un certo trattamento che sapevo influenzasse il citoscheletro di actina, che ovviamente non ho utilizzato come housekeeping, ma usando beta-Tubulina ho visto che anche questa ne veniva in qualche modo influenzata, non era affatto stabile nei campioni trattati e non trattati, quindi era impossibile una qualunque quantificazione della proteina che stavo studiando normalizzando rispetto a beta-tubulina.
Inoltre una mia collega si è fatta un bello sbattimento di caratterizzare cellule ottenute da topi WT e KO, per un'altra proteina (non del citoscheletro) e ha analizzato diversi housekeeping mediante WB, la beta actina variava notevolmente! Nonostante anche per questa proteina non ci fosse nessuna correlazione con la tubulina.
In generale, questo vale per qualunque tipo di esperimento, bisognerebbe verificare che un housekeeping lo sia davvero! E magari verificare utilizzando diversi "housekeeping".
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Discussione |
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housekeeping per western blot
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