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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
 Inserito il - 07 maggio 2009 : 13:33:05
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Volevo un parere o un consiglio su come coltivare cellule che crescono aderenti su coverslip in multiwell. Cioe' se versate direttamente la quantita' di medium contenente gia le cellule o versate prima un goccia contenente le cellule sul vetrino e poi aggiungete il medium...
grazie
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2009 : 14:15:46
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| se versi una "goccia" sul vetrino, come fai poi a sapere quante cellule hai piastrato? io in genere prima le stacco dalla piastra, poi le conto, le risospendo e poi mi prendo la quantità di cellule totali da piastrare. a quel punto porto a volume e piastro su coverslip. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2009 : 19:15:18
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Scusa mi sono spiegato male,dopo aver fatto i passaggi che dici li piastri direttamente nel pozzetto della multiwell contentente il vetrino. O per evitare che le cellule crescono anche intorno e talvolta sotto il vetrino piazzi primi una goccia,aspetti che le cellule iniziano ad attaccarsi alla coverslip,e poi riempir il pozzetto con il midium...
Un'altra cosa,prima di utlizzare il vetrino,gli fate un lavaggio in etanolo assoluto,poi lo mettete ad asciugare nel pozzetto della multiwell,e poi fate un lavaggio in pbs e midium...O lo usate direttamente preso dalla scatola sterile senza nessun lavaggio...
grazie |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2009 : 19:47:40
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Allora il problema è questo, dipende da quante cellule sono!
Dovresti verificare sperimentalmente quale metodo è migliore perchè si possono verificare i seguenti problemi:
- se le cellule sono molte mettendo la goccia al centro della coverslip cresceranno tutte ammassate al centro e non vedrai molto bene in IF.
- se sono poche e le metti già in tutto il medium rischi di perderne molte e quindi sulla cover te ne rimangono poche e non hai dei buoni risultati in IF
In genere la cosa migliore è mettere la goccina e poi aggiungere il resto del medium, tenendo presente però quanto detto sopra, magari la "goccina" fai in modo che ricopra tutta (o quasi) la superficie della coveslip e che non sia troppo concentrata al centro.
Se ti rendo conto che la "goccina" è troppo poca aggiungi subito una piccola quantità di medium e spipetta un po' per spargerle sulla coveslip, poi quando si sono attaccate aggiungi il resto del medium.
Dimenticavo, riguardo i lavaggi io non li faccio, ma in realtà non uso vetrini ma "plastichini" fatti apposta, e in genere faccio anche il coating per far aderire meglio le cellule, ma anche qua dipende dalle cellule che usi.
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 07 maggio 2009 : 20:45:39
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Grazie mille per i consigli...Comunque stiamo lavorando con cellule muscolari umane (cellule satelliti) estratte da biopsia.
Di solito piastro direttamente con il midium, non utilizzo la goccia perchè il problema che potrebbe succedere e che se lasci troppo tempo solo la goccia, si asciuga il vetrino e muoiono le cellule. Dove sto lavorando adesso mi hanno detto di provare con la goccia ma ho notato che non rimane interamente sul vetrino se eseguo i lavaggi.. Ma non so se è i vetrini sono sterili o devo per forza fare il lavaggio in etanolo ed ovviamente devo successivamente fare un lavaggio almeno in pbs...Non posso piastrare su vetrini trattati solo con etanolo...non credi?
Quindi non so cosa fare..
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2009 : 12:59:09
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Ciao, per quanto riguarda i vetrini io faccio così e non ho mai avuto problemi: prendo il vetrino con una pinza(sterile) lo immergo per qualche secondo in una falcon da 50ml contenente EtOH 70%, subito dopo lo immergo sempre per qualche secondo in un'altra falcon da 50ml contenente EtOH 100% (elimina eventulai residui di acqua). Poi, prendo il vetrino e lo poggio nella multiwell lasciando il coperchio aperto in modo tale da far evaporare tutto l'etanolo. Una volta asciutti i vetrini piastro le cellule (prima il medium, poi le cellule e agito delicatamente) in modo tale che il giorno arrivino quasi a confluenza (circa il 90%) così sono sicura di avere il vetrino completamente ricoperto di cellule (io lavoro con multiwell da 6). Non so se sono stata chiara ciao spero di esserti stata utile |
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2009 : 19:20:44
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Ok..grazie
Ti è mai capitato con questa tecnica che una volta seminate le cellule nel pozzetto della multiwell,il vetrino si stacchi leggermante e le cellule crescono sotto il vetrino?..
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2009 : 08:43:23
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Fin'ora non mi è mai capitato in realtà, perchè il vetrino aderiva sempre bene sul fondo tant'è che alla fine per staccarlo perdevo la pazienza
Comunque quando seminavo le cellule lo facevo molto delicatamente, proprio per evitare che mi accadesse questo, appoggiando la pipetta sulla parete verticale della well (non troppo in alto però) e facendo scorrere il medium lentamente. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2009 : 10:47:29
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per i vetrini, io li lascio in falcon per una notte in etanolo 100%, il giorno dopo li stendo su carta di alluminio, ci passo sopra la fiamma del bunsen e poi li mando ad autoclavare. in questo modo sono sterili sgrassati. invece, per quanto riguarda le cellule che crescono sotto il vetrino, appena dopo la piastratura io passo un puntale giallo sul vetrino, in modo che lo schiaccio se dovesse essersi sollevato.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2009 : 11:04:06
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| Io li lasciavo in HCl 1M a 55°C o/n (sotto cappa chimica e con cautela mi raccomando!), li lavavo con acqua distillata e poi li sciacquavo in EtOH. Poi li portavo sotto cappa sterile, li passavo delicatamente sul bunsen, prima di metterli nella multiwell che lasciavo per 20-30' sotto gli UV prima dell'uso. |
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2009 : 12:13:33
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Grazie mille per le info che mi avete dato. Vedo che posso utilizzare diverse metodiche,ma l'importante è evitare il distacco del vetrino cosa che non mi è mai successa piastrando direttamente il medium contenente le cellule. Proprio perchè il vetrino una volta messo in multiwell e trattato con i lavaggi aderisce bene e non crea nessun problema...
Comunque provero' un po le diverse soluzioni suggeritemi e poi scegliero' quella che mi darà i risultati migliori..
Grazie ancora a tutti |
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 18:05:43
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Comunque tt bene con l'immunofluorescenza ma volevo chiedere solo una cosa..ho notato che quando monto le coverslips su glass slide microscopy e devo bloccarli con nail polish tendono a muoversi..questo puo' danneggiare le cellule? Potrei pressare leggermente il vetrino per far uscire laterlamente un po di mounting media?
Grazie |
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Immunofluorescenza
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