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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
 Inserito il - 22 marzo 2006 : 16:46:15
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Sto cercando di amplificare un frammento di 3700 bp usando la Fusion..
ma anche abbassando drasticamente l'anneling temperature, usando DMSO e facendo 35 cicli non ho amplificati  ! Quello che vedo e' una grossa banda proprio sotto al pozzetto (in un gel 0.8%)!
Suggerimenti, consigli?
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 16:59:25
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che tempi di elongation hai?
io per amplificare l'intero plasmide sono sui 5 minuti... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 18:24:36
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Anch'io direi di controllare i tempi di elongation anche se forse il problema non è questo, se sono troppo corti dovresti vedere uno smear sul gel e non una banda a peso molecolare alto (appena sotto il pozzetto!).
Comunque ho solo una vaga idea di cosa sia la Fusion-PCR, qualcuno sa indicarmi un sito, un libro, qualcosa... che spiegi esattamente cos'è?
Grazie |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 19:50:34
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Di solto usavo 2 minuti (30 sec per kb!), ma ho provato anche con 4 minuti!!!!
La fusion e' proprio quella indicata da Alexo.. nessuno che l'abbia gia' usata con succeso con frammenti LUNGHI??? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2006 : 00:50:10
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Citazione:
Messaggio inserito da AleXo
forse Valia intendeva questa polimerasi:
http://www.neb.com/nebecomm/products/faqproductF-530.asp
Grazie mille!
Io pensavo che si riferisse alla Fusion-PCR che è una tecnica che a quanto ne so permette di legare assieme due frammenti mediante PCR, senza clonaggio con enzimi di restrizione, ma non so esattamente come funzioni!
Per quanto riguarda la Phusion DNA Polimerasi, mi spaice ma non posso essere d'aiuto non l'ho mai ustata, ma nel link di AleXo ho visto che ci sono anche i Troubleshooting, ma probabilmente li hai già letti! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2006 : 11:09:16
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Esattamente.. ho gia' letto tutto!
Mi piacciono soprattutto i consigli "rifai tutto da capo" oppure "riprogetta i tuoi primers"  !
Thanks anyway!
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2006 : 10:35:23
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Solo per farvi sapere che alla fine ce l'ho fatta  !
Ok, non ho usato la Fusion, ma una combinazione di Taq e Pfu, una polimerasi con attivita' esonucleasica 3'--> 5'! Ok, ho mantenuto una temperatura di annealling molto bassa.. ma ho avuto una banda piu' che decisa, e pochissimo aspecifico!
Il prossimo step sara' fare un gradiente per trovare la temperatura ottimale!
EVVIVA!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2006 : 19:27:23
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Sono contenta che tu abbia risolto il problema!
Comunque oggi per caso, seguendo un corso di realtime che non c'entra niente, con uno specialist della ditta abbiamo parlato anche della fusion (che loro vendono!). Così ho colto l'occasione per fargli alcune domande e mi ha detto che è un enzima con processivita molto alta, maggiore rispetto alle classiche proof reading (Pfu e Pfx) quindi in sostanza ci mette meno tempo ad amplificare... cioè il tempo di elongation va ridotto e non aumentato!!! Se l'enzima si "ferma" troppo sul templato inibisce la PCR anzichè aumentarla. Lo stesso vale per la concentrazione di enzima che va ridotta altrimenti in quantità elevate inibisce! Magari il tuo problema era questo??? mah? Comunque abbiamo (o almeno ho!) imparato qualcosa di nuovo... che non fa mai male!
Buona fortuna per il seguito dei tuoi esperimenti! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2006 : 20:46:49
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Grazie mille! Comunque non penso che il problema fosse quello perche' all'inizio usavo i tempi da loro indicati (ossia 30 sec per kb). Guarda, ora sto usando la Pfu e mi trovo benissimo.. anche se la PCR e' un po' lunga (4 ORE  !!!) dovendo usare tempi di elongation standard (che fanno 4 minuti per ciclo!!). Comunque non mi lamento!
Ciao ciao
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