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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
 Inserito il - 14 maggio 2009 : 22:33:46
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Ehi qualcuno mi sa spiegare cosa succede quando sul film che si sviluppa dopo un western blot,si ritrovano le normali bands e bands negative o bianche...?
Grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2009 : 22:55:15
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| Che la reazione è stata troppo forte e ha bruciato la lastra, in genere in corrispondenza delle bande "bianche" sulla lastra si vedono anche delle bande marroncine sulla membrana. |
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2009 : 22:57:49
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Grazie...
ma quindi vuol dire che è stato troppo il tempo d'esposizione? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2009 : 23:09:08
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Può essere quello, ma in genere è proprio che la reazione chemiluminescente è troppo forte, viene consuato velocemente tutto il substrato e si brucia la membrana.
Riesponendo la lastra una seconda volta potresti ottenere un segnale migliore, ma non sempre!
Altrimenti devi diminuire la quantità di proteine che carichi sul gel e ridurre la concentrazione degli anticorpi.
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2009 : 23:38:38
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Quindi non posso riutilizzare quella membrana,devo necessariamente rifare il gel....
grazie mille.. |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2009 : 10:39:08
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| Un'ulteriore prova che potresti fare è rifare l'ECL però questa volta diluendolo 1:1 con 1x PBS ad es: 1ml ECL + 1ml PBS 1x. Questa è più immediata, altrimenti dovresti provare a "strippare" il filtro e ad incubarlo con una concentrazione inferiore di anticorpi...però finchè fai tutto questo conviene sempre rifare il gel caricando una quantità minore di proteine come ha detto GFPina |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2009 : 12:04:29
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Come ti ho già detto e come dice anche angemore, probabilmente la membrana non è più utilizzabile.
Come dicevo puoi provare a riesporla, tenendo meno la soluzione chemioluminescente (ECL o quello che usi), potresti ottenere un risultato migliore la seconda volta, ma non è detto!
Rifare il gel modificando alcuni fattori ti dà sicuramente maggiori possibilità di riuscita.
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JULIO
Nuovo Arrivato
83 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2009 : 20:16:57
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Ehi ragazzi ieri ho fatto lo staining cn india ink alla membrana di nitrocellosa per poter fare dopo un wb. Dopo averla "colorata" ed asciugata nn so come mai ma nn si vedevano piu le bande che invece erano presenti appena messa ad asciugare...qualcuno m saprebbe dare una spiegazione!!
Non era mai successo prima.... |
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mgbiotec
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2009 : 17:32:46
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Io invece ho un altro problema, alquanto strano a dir la verità....
Ho trasferito, come al solito, le mie proteine su membrana di nitrocellulosa (Whatman Protran). Questa inspiegabilmente dopo il ponceau si colora di azzurrino.  La tonalità aumenta un pochino dopo i primi lavaggi in TBS-t. Come mai? Sembra che qualcosa viri  |
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chick80
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Città: Edinburgh
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Western Blot
Didattica e Relazioni
