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The Elvenking
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3 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 15:59:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di The Elvenking Invia a The Elvenking un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, sono uno studente iscritto al terzo anno del corso di laurea in CTF. Tra i corsi che ho seguito quest'anno, ve n'è uno chiamato BIOCHIMICA AVANZATA, incentrato sulle metodiche biochimiche e di biologia molecolare utilizzate per espressione di proteine ricombinanti nei diversi vettori, e le strategie di purificazione e isolamento delle proteine stesse.
La docente di questo corso pretende da tutti noi studenti la stesura di una tesina il cui scopo è sottoclonare un enzima/proteina in un vettore di natura plasmidica, per farla esprimere in un ceppo di E.Coli, e di suggerire un protocollo per la sua purificazione: tutto questo a livello puramente teorico, senza nessuna esercitazione di nessun tipo a livello pratico e utilizzando solo software disponibili in internet per reperire sequenze nucleotidiche e decidere gli enzimi di restrizione da usare .

Mi rivolgo a voi, per avere, se possibile, dei suggerimenti e degli indizi su come affrontare la stesura del protocollo di purificazione, dato che mi trovo piuttosto in difficoltà a causa della trascuratezza con cui è stato svolto il corso.

Il titolo del lavoro è

TXK TYR KINASE [Homo Sapiens]
Espressione in Escherichia Coli; T7-tag all'N terminale; His-tag al C-terminale

Uso del vettore pET21b

Ringrazio in anticipo chiunque vorrà intervenire in qualunque modo e mi scuso per la lunghezza abnorme del mio intervento

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 18:24:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Suggeriscile il genialissimo kit dario renio http://lnx.molecularlab.it/loops-flair/index.php?option=com_content&view=article&id=56:danio-rerio-multiple-protein-expression-kit&catid=37:in-vivo&Itemid=57

A parte gli scherzi,
la produzione di proteine ricombinanti è una tecnica che permette di produrre proteine endogene utilizzando la tecnica del DNA ricombinante.Si amplifica il gene che codifica la proteina tramite PCR da DNA genomico o tramite RT-PCR partendo dall’mRNA.L’inserto così amplificato viene inserito nel vettore di espressione plasmidico.I plasmidi hanno la capacità di replicarsi molto in fretta indipendentemente dalla divisione cellulare,inoltre consentono la produzione di una grande quantità di mRNA codificante.Il plasmide ricombinante viene introdotto in sistemi di espressione.I sistemi di espressione possono essere sia cellule procariotiche che eucariotiche.La scelta del sistema dipende dalla natura del prodotto proteico desiderato.Di solito si preferiscono i batteri che sono molto facili da maneggiare e sono molto economici da crescere.La produzione di proteine in batteri è molto diffusa basti pensare alla produzione su larga scala di insulina in cellule batteriche del ceppo di E.Coli.Le cellule eucariotiche vengono utilizzate quando si vuole produrre una proteina che per essere attiva richiede modificazioni post-traduzionali
fatto questo preambolo torniamo al nostro caso,visto che la sua espressione deve avvenire in E.Coli, tale proteina non dovrebbe subire modificazioni post-traduzionali quindi la prima cosa da fare è

Il trascritto e' questo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_003328.2?report=genbank
estrarre l'RNA dalle cellule e retrotrascriverlo in cDNA,in maniera tale da avere solo la sequenza codificante priva di introni

Disegnare dei primers che presentino nella parte 5' dei siti di restrizione e che annilano sulle UTR 5' e 3' ed amplificare il cDNA,ovviamente quando caricherai sul gel potrai vedere più di una banda,dove una corrisponderà al pre-mRNA ed altre bande (eventualmenete ci siano) dovute agli splicing alternativi

a questo punto bisogna eluire la banda di nostro interesse dal gel,tagliare le estremita' con enzimi di restrizione o eventualmente fare un subclonaggio qualora le estemità non permettano il taglio a causa di una ridotta lunghezza e inserire il nostro frammento all interno del vettore pET21b

Per la trasformazione in E.Coli possiamo utilizzare diverse metodologie,una tra le tante lo heat-shock

bisogna attendere la crescita dei batteri in un terreno LB in presenza di un antibiotico in modo tale da selezionare solo i batteri che hanno all'interno il plasmide

i vettori pET sono dei vettori che presentano un sito di clonaggio multiplo (MCS) per facilitare il clonaggio del gene o del cDNA da esprimere,promotori forti nel nostro caso T7 e che sono inducibili da IPTG oltre che la sequenza che promuove un efficiente inizio di traduzione, detta sequenza Shine-Dalgarno che è seguita dal codone di inizio della traduzione. Questi due segnali assieme costituiscono il Ribosome Binding site (RBS).
Un terminatore della trascrizione, che consenta il distacco dell’RNA polimerasi e il suo rapido riciclo.
un sito di clonaggio multiplo (MCS) per facilitare il clonaggio del gene o del cDNA da esprimere oltre che un sito His-tag nella regione carbossi terminale che servirà per la purificazione della proteina

quindi introducendo IPTG si avrà l'espressione della proteina e a questo punto bisognerà purificarla.
Per fare ciò si effettua una cromatografia e la fase stazionaria è rappresentata da una resina dove la coda di polistidina aggiunta alla proteina, permette la sua separazione dalle altre componenti attraverso una procedura di affinità. Gli ioni presenti in soluzione (Nichel Ni++), formano dei legami di coordinazione con gli anelli imidazolici delle istidine della proteina ricombinante e con i residui della matrice,una volta effettuata la separazione, la proteina viene eluita con una soluzione contenente elevate concentrazioni di imidazolo, il quale competerà con la proteina per il legame con la matrice

buon dosaggio





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The Elvenking
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2009 : 19:52:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di The Elvenking Invia a The Elvenking un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille

Mi hai confermato la mezza idea che avevo. Mi domandavo se forse il T-7 tag nn creasse delle complicanze nel processo...
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angemore
Nuovo Arrivato



82 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2009 : 10:41:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di angemore Invia a angemore un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qui trovi scritto nel dettaglio tutto quello che ti ha riassunto Patrizio fino all'espressione della proteina:
http://130.15.90.245/methods/handbooks%20and%20manuals/Novagen%20pET%20system%20manual.pdf
Per quanto riguarda la purificazione preciso solo una cosa: l'eluizione può essere fatta, oltre che con concentrazioni crescenti di imidazolo che compete con l'istidina per il legame al Nichel, anche con variazioni di pH (via via sempre più acido)
Qui trovi invece protocolli di purificazione in condizioni native o denaturanti con la resina al nichel:
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB273.pdf
Anche qui è descritto bene come si purifica con la resina al nichel e ci sono delle immagini utili:
http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000146
(devi cliccare su QIAexpressionist)
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