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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2009 : 23:22:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti, mi chiamo eva, lavoro su un progetto sull'HIV2 che prevede anche una parte di sequenziamento. La banda su gel dell'amplificato purificato e' bella pulita e all'altezza giusta, l'elettroferogramma del pGem di controllo viene perfetta, il mio campione invece niente, uno schifo! tra l'altro il frammento sequenziato dovrebbe essere lungo circa 110 basi invece me lo ritrovo di circa 90. io uso l'abi prism, vi allego gli elettroferogrammi in formato zip (non ci sono virus), sapreste dirmi qual e' la possibile causa e come fare per migliorarla?

vi ringrazio in anticipo!!!!

Allegato: sequenze.zip
69,1 KB

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 17 maggio 2009 : 21:48:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Eva,
benvenuta su MolecularLab!
Non mi sono chiare alcune cose, tu come fai a sequenziare?
Sequenzi il prodotto di PCR o è un frammento presente in un vettore?
Dove sono posti i primers che utilizzi?
Ad es. se è un frammento lineare di PCR e i primers sono posti alle estremità è normale che tu non riesca a sequenziarlo tutto, ma ti perdi dei pezzi all'inizio e alla fine, e questo potrebbe spiegare il fatto che hai una sequenza di 90 anziché 110.
Poi guardando gli elettroferogrammi in effetti sembrano sporche le sequenze.
Magari prova a dare un occhiata anche al troubleshooting del servizio di sequenziamento di BMR Genomics (CRIBI di Padova): http://www.bmr-genomics.it/seq_index.html
ci sono degli esempi di sequenze mal riuscite e le possibili cause e risoluzioni!

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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 18 maggio 2009 : 13:50:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! grazie per il benvenuta e per la risposta!!!
allora, prima amplifico (semplice PCR) e poi sequenzio il frammento lineare usando gli stessi primer dell'amplificazione...dopo la PCR faccio il gel e la banda mi viene all'altezza giusta (110 basi), quando poi sequenzio (uso la Big Dye v.3.1 e abi prism 310) vedo che le sequenze arrivano verso le 80-90 basi...sinceramente non mi era mai successa una cosa cosi' (prima sequenziavo borrelia burgdorferi).
Avevo provato a guardare nel troubleshooting: il mio caso sembra ricondursi a sequenza doppie e come soluzione mi dà cambiare primer....
come soluzione estrema tentero', e' che il frammento e' gia piccolo di suo....magari qualcuno di voi aveva risolta in altra maniera....
ho pensato anche di controllare che non ci siano siti multipli di attacco dei primer....provero'...
comunque grazie mille per l'interessamento!
buon lavoro
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 18 maggio 2009 : 16:35:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh potrebbe anche essere un problema di "cattiva" purificazione.
Hai provato a ripurificare, utilizzare un altro metodo di purificazione?
o estrarre la banda da gel, anche se non è il metodo preferenziale, ma se è presente qualche altro frammento nella tua PCR non visibile su gel è l'unico metodo per eliminarlo.
Altro problema potrebbe essere che sono ancora presenti i primers della PCR nella reazione di sequenziamento, e questo può dare origine a sequenze doppie.

Per quanto riguarda la lunghezza, non ho le mie sequenze con me ed è passato un bel po' di tempo, però mi ricordo che quando sequenziavo frammenti lineari con gli stessi primers con cui facevo la PCR la sequenza era sempre più corta rispetto alla banda.
Per aumentare la lunghezza (anche se non mi sembra il problema principale in questo caso) puoi clonare in vettori per il sequenzaonemi oppure fare la prima PCR aggiungendo delle cose ai primers e poi disegnare i primers per la sequenza su quelli.

Si, controlla anche se non ci sono altri siti dove si possono attaccare i primers.

Non sempre il sequenzaimento di un prodotto di PCR è così semplice, magari leggiti anche questo link: Direct Sequencing of PCR Products
ti può dare dei suggerimenti interessanti.

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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 18 maggio 2009 : 16:57:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie i consigli del link sono utilissimi, ne faro' buon uso!
grazie ancora per l'aiuto, purtroppo lavoro da sola su questo progetto...
buon lavoro!
ciao
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2009 : 09:46:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
effettivamente è un po' corta la sequenza ...capisco l'inizio che e' abbastanza normale perderlo,ma visto che non sono frammenti molto lunghi l'estremità dovresti averla,
aggiungo solo una cosa agli utili suggerimenti precedentemente detti,
il sequenziatore e' molto sensibile alle diverse concentrazioni descritte nel kit,quindi dosa benissimo il DNA prima di fare la marcatura, devi essere molto precisa ,e inoltre usa il buffer ( te lo dico perchè ci sono alcuni non lo usano )


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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 11:04:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao Patrizio....
cosa intendi per usa il buffer? per l'abi prism? uso buffer edta 1x....
provero' a controllare anche la concentrazione....
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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 12:17:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cciao a tutti!
sono sempre io!
ho dato un'occhiata al link "Direct Sequencing of PCR Products" suggeritomi da GFPina... nella pagina per il calcolo della concentrazione del templato, ho visto che la concentrazione dei primer da usare dovrebbe essere 1 pmol per microlitro ....io ho sempre usato una concentrazione di 3,2 pmol per microlitro....non ho mai avuto problemi in altri sequenziamenti, ma pensate che nel caso specifico la concentrazione troppo elevata possa essere la causa della bruttezza delle mie sequenze?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 13:34:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sono andata a controllare, per le mie sequenze che spedivo a BMR genomics erano 3,2pmoli totali di primers per reazione, non 3,2pmol/ul!
In effetti facendo i conti 3,2pmol/ul sembrano molto! Puoi provare con meno.
Io comunque come prima cosa mi assicurerei che il prodotto di PCR sia purificato bene. Non so che metodo hai utilizzato, ma a me è capitato che prodotti di PCR purificati con exosap dessero delle sequenze tremende! Ripurificati estraendo la banda da gel le sequenze venivano benissimo!

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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 13:47:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
bene! mi avete proprio chiarito le idee, adesso so cosa fare per provare a migliorarle!


Grazie mille e buon lavoro!!!!
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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 13:55:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
PS: in effetti io ho usato 1 microlitro di ogni primer con concentrazione 3,2 picomoli per microlitro, ossia 3,2 picomoli in totale...
ossia come fai tu GFPina...
vabbe' niente....provero' ad estrarre la banda e a purificarla....
ciaoooo
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 14:40:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da martineva

cciao a tutti!
, ma pensate che nel caso specifico la concentrazione troppo elevata possa essere la causa della bruttezza delle mie sequenze?



A me è successo


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 15:53:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa martineva fammi fare una precisazione!
Un conto è dire la "quantità" di primer che usi per ogni reazione (ad es. 3,2 picomoli) e un conto è la concentrazione.
Se tu hai fatto così:
Citazione:
io ho usato 1 microlitro di ogni primer con concentrazione 3,2 picomoli per microlitro, ossia 3,2 picomoli in totale

siamo d'accordo che hai usato una quantità totale di 3,2 picomoli per la tua reazione, ma la concentrazione non è 3,2picomoli/ul perché quella è la "concentrazione iniziale" del primer, non la concentrazione nella reazione di sequenziamento! E questo dipende da in che volume fai la reazione di sequenziamento!
Dal link che ti ho postato loro dicono di mandare 10ul di primer concentrato 1pmol/ul, quindi una quantità totale di 10pmoli, non so poi in che volume facciano la reazione.
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martineva
Nuovo Arrivato

Prov.: Udine
Città: Basiliano


8 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 18:58:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di martineva Invia a martineva un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
dunque siamo d'accordo

io parlavo di concentrazione dei primer che poi avrei messo nella mix di reazione; e' logico che la concentrazione dei primer in miscela e' inferiore rispetto a quella iniziale (o se vuoi la diluizione e' maggiore)....
cque non ti preoccupare, mi sono capita io!
grazie, ciaooooo
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2009 : 22:57:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quindi per far capire anche ad altri eventualmente...bisogna prestare attenzione anche alla concentrazione del campione da sequenziare


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babilei
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2009 : 20:21:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di babilei Invia a babilei un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao
ho visto solo ora la discussione, per cui spero tu abbia già risolto.
Se non è così ecco la mia analisi.

Premetto che non ho esperienza con il 310 ma ho dato un occhio ai cromatogrammi e il problema sembra essere di elettroforesi legato alla purificazione della pcr, dato che nel controllo il problema non sussiste.
COSA SI VEDE:
- i picchi sembrano trascinarsi, ossia prima del picco principale è visibile un picco più basso dello stesso colore.
- il dato grezzo mostra la linea di base non piatta ma frastagliata verso l'alto
- il dato grezzo ha un segnale molto alto (8000 contro i 3000 di media del controllo e per un sequenziatore di ultima generazione è molto alto).

CAUSE
Questi sono tutti sintomi di problemi di contaminanti nel campione che alterano la migrazione dei frammenti dando un effetto di trascinamento.

SOLUZIONE
1) purificare meglio la PCR evitando se possibile il gel di agarosio
2) usare meno DNA per la reazione (1ng ogni 100 basi); riduce il segnale e quindi il sovraccarico del capillare e contemporaneamente la quantità totale di eventuali contaminanti.
3) caricare meno campione sul sequenziatore (abbassare i parametri di injection)


Per quanto riguarda la lunghezza della sequenza, è normale che non veda la sequenza del primer dato che la elongazione, e quindi il primo frammento marcato che si genera, parte dalla prima base dopo il primer. Quindi la sequenza deve essere lunga, base più base meno, come la PCR meno la lunghezza del primer.

Ciao
Barbara
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